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    eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞增殖和紅系分化的影響

    2014-12-07 08:05:10薛建有桑婷婷戚武林曹玲玲毛群銓朱曉芳張世馥
    關(guān)鍵詞:聯(lián)苯胺紅系亞型

    薛建有,桑婷婷,戚武林,曹玲玲,毛群銓,朱曉芳,張世馥

    目前已發(fā)現(xiàn)一些因子參與調(diào)控紅系分化。GATA1是一個(gè)至關(guān)重要的造血轉(zhuǎn)錄因子,GATA1/FOG1復(fù)合體通過(guò)激活α-珠蛋白和EKLF基因的表達(dá)而抑制GATA2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)紅系分化[1]。PU.1與GATA1的作用恰好相反,可阻礙紅系分化。在HMBA或DMSO誘導(dǎo)分化的MEL細(xì)胞中GATA1表達(dá)上調(diào)而PU.1表達(dá)下調(diào),GATA1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致MEL細(xì)胞紅系分化,但這種GATA1的誘導(dǎo)作用可被PU.1的上調(diào)表達(dá)抑制[2]。PU.1與GATA1相結(jié)合導(dǎo)致GATA1級(jí)聯(lián)信號(hào)通路的阻斷而阻礙了紅系分化進(jìn)程。c-Myc在紅系分化過(guò)程中表達(dá)下調(diào),其過(guò)表達(dá)阻礙Rac2和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)Gcn5下調(diào)表達(dá)從而導(dǎo)致珠蛋白H3和H4乙?;⒆璧K了核固縮和排核[3]。真核生物翻譯起始因子 4H(eIF4H)最早在兔子網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),在eIF4B和eIF4F缺少的情況下可促進(jìn)血紅蛋白的合成[4]。然而eIF4H是否對(duì)白血病細(xì)胞增殖和紅系分化的產(chǎn)生影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究通過(guò)構(gòu)建eIF4H低表達(dá)的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株,通過(guò)觀察eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞體外增殖和紅系分化的影響,為進(jìn)一步探究eIF4H在白血病發(fā)生中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

    HEK293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心),MEL細(xì)胞(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng))。

    載體質(zhì)粒 pLKO.1、對(duì)照質(zhì)粒 pLKO.1-TRC(scramble)、包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG和pCMV-dR8.2(Addgene公司)。

    1.2 試劑

    胎牛血清(Hyclone公司);MEN培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);嘌呤霉素、丁酸鈉和MTT(Sigma公司);轉(zhuǎn)染試劑 LipofectanineTM2000(Invitrogen公司);PI凋亡染色試劑盒(南京凱基生物);兔抗小鼠eIF4H單克隆抗體(CST公司);小鼠抗人β-actin單克隆抗體和羊抗小鼠 IgG單克隆抗體(Sigma公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):MEL和HEK29T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)中,于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng),每隔2 d傳代1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.3.2 含shRNA干擾序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計(jì)的兩對(duì)eIF4H靶序列分別為eIF4H-shRNA-1:5'-GAGACAAAGACACAGACAAAT-3';eIF4H-shRNA-2:5'-ACTCGCACACCAACCTTATAT-3'。小發(fā)夾shRNA干擾片段經(jīng)退火后與pLKO.1-TCR質(zhì)粒載體鏈接。選取scramble-shRNA作為陰性對(duì)照,此序列在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有靶向基因,對(duì)細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有影響,序列如下:5'-GCCAATCGTTCTCTGACAGAA-3'。

    1.3.3 慢病毒包裝:HEK293T細(xì)胞按7×105/mL接種于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜;再用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h,加入16μg質(zhì)粒(7.5μg pLKO.1,2.9 μg pCMV-VSVG,5.6 μg pCMV-dR8.2)和15μL LipofectanineTM2000,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,換成完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)96 h后,收集含有病毒的上清液,-80℃儲(chǔ)存。

    1.3.4 eIF4H低表達(dá)的MEL細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建:MEL細(xì)胞按每孔4 500個(gè)細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),加入1 mL DMEM培養(yǎng)基,將pLKO.1-scrambleshRNA(scramble-shRNA)、pLKO.1-eIF4H-shRNA-1(eIF4H-shRNA-1)和 pLKO.1-eIF4H-shRNA-2(eIF4H-shRNA-2)3種病毒分別加到細(xì)胞懸液中。侵染96 h后,棄去上清培養(yǎng)基,用0.5μg/mL的嘌呤霉素篩選含抗性基因的細(xì)胞。最后通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eIF4H的表達(dá)情況。

    1.3.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖:取各組細(xì)胞按3 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中,每孔200μL。設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照組,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。于含5%CO2,37 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24、48、72、96和120 h后,每孔加入10μL 5 g/L的MTT溶液,避光孵育4 h后棄培養(yǎng)基,加入150μL DMSO,待紫色結(jié)晶充分溶解,A595nm處測(cè)定吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),A595nm為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

    1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞周期的影響:收集各組細(xì)胞,PBS洗3次,70%乙醇固定至少24 h。根據(jù)凱基PI凋亡染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

    1.3.7 聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)細(xì)胞的紅系分化情況:取各組細(xì)胞按1.5×104/mL接種于24孔板中,加入1.25 mmol/L誘導(dǎo)劑丁酸鈉,對(duì)照組不加藥。加藥后3~5 d分別取各組細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)苯胺染色。收集細(xì)胞,1 000 r/min,離心3 min;棄上清,加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液(0.85%)洗1次,去除殘留培養(yǎng)基;加入預(yù)混的聯(lián)苯胺染液:30%H2O2(50∶1,v∶v)100μL;滴片后鏡檢,統(tǒng)計(jì)聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 eIF4H蛋白低表達(dá)穩(wěn)定株的建立

    圖1A和B顯示轉(zhuǎn)染效率較高。eIF4H基因通過(guò)選擇性的剪接5位外顯子產(chǎn)生兩個(gè)蛋白亞型,亞型Ⅰ約27 ku,亞型Ⅱ約25 ku。圖1 C顯示與對(duì)照組相比eIF4H-shRNA-2組eIF4H兩個(gè)亞型表達(dá)均下調(diào)。

    2.2 eIF4H蛋白低表達(dá)抑制MEL細(xì)胞的增殖

    與對(duì)照組和scramble-shRNA細(xì)胞相比,eIF4H-shRNA-2細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。對(duì)照組、scramble-shRNA和eIF4H-shRNA-1細(xì)胞在3 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期,在4 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,而eIF4H-shRNA-2在4 d時(shí)才達(dá)到平臺(tái)期(圖2)。

    2.3 eIF4H低表達(dá)阻礙了MEL細(xì)胞的周期進(jìn)程

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,eIF4H低表達(dá)后MEL細(xì)胞的周期G1期增加,S期減少,表明eIF4H低表達(dá)阻礙MEL細(xì)胞周期在G1期(圖3)。

    2.4 eIF4H低表達(dá)促進(jìn)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化

    不加誘導(dǎo)劑丁酸鈉時(shí),兩組細(xì)胞均檢測(cè)不到聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞。當(dāng)加入誘導(dǎo)劑丁酸鈉處理后,eIF4H-shRNA-2組聯(lián)苯胺陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于scramble-shRNA組(p<0.01)(圖4)。

    3 討論

    蛋白質(zhì)合成最主要的調(diào)控發(fā)生在翻譯起始階段,該過(guò)程需要多種eIF的調(diào)控。已發(fā)現(xiàn)一些eIF在腫瘤組織中是高表達(dá)的,eIF4E在多種癌細(xì)胞中高表達(dá),過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和成瘤[5]。eIF4G在肺癌中高表達(dá)[6]。RNA解旋酶eIF4A在黑色素瘤和肝癌中高表達(dá)[7-8]。eIF4H在結(jié)腸癌中高表達(dá),其表達(dá)下調(diào)后抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖同時(shí)可誘導(dǎo)凋亡,這種抑制和誘導(dǎo)作用可通過(guò)cyclin D1的過(guò)表達(dá)來(lái)消除[9]。

    eIF4H是一個(gè)重要的真核生物翻譯起始因子,能夠在蛋白質(zhì)翻譯的起始階段促進(jìn)核糖體向起始密碼子掃描,從而加速蛋白質(zhì)的合成。降低蛋白質(zhì)的合成被認(rèn)為與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)了MEL細(xì)胞中eIF4H兩個(gè)亞型的表達(dá),為進(jìn)一步探究eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞增殖和紅系分化的影響提供了一個(gè)合適的細(xì)胞模型。MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,eIF4H低表達(dá)后MEL細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制,同時(shí)細(xì)胞周期阻滯在G1期,這意味著eIF4H低表達(dá)介導(dǎo)了MEL細(xì)胞的惡性逆轉(zhuǎn)。

    圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析eIF4H低表達(dá)對(duì)MEL細(xì)胞周期的影響Fig 3 Flow cytometry analyzed the effect of eIF4H down-expression on the cell cycle of MEL cells

    圖4 聯(lián)苯胺染色檢測(cè)eIF4H低表達(dá)對(duì)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化的影響Fig 4 Benzidine staining analyzed erythroid differentiation of MEL cells affect by eIF4H down-expressed

    eIF4H低表達(dá)抑制了MEL細(xì)胞增殖的同時(shí),是否會(huì)調(diào)控紅系分化?本研究聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示,eIF4H低表達(dá)并不能誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化,但可促進(jìn)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL紅系分化。這可能是由于對(duì)紅系分化的調(diào)控往往表現(xiàn)在表達(dá)量的變化和細(xì)胞定位的遷移兩個(gè)層面,單一因素的改變并不能誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化。

    總之,本研究明確了eIF4H低表達(dá)可抑制MEL細(xì)胞增殖,并可促進(jìn)丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞紅系分化,將為闡明白血病的發(fā)生和治療提供新的理論依據(jù)。

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