精氨酸酶-1在肝細(xì)胞癌中的低表達(dá)及其臨床意義

顧春燕 肖鋒 錢錚 邵建國(guó) 秦剛 陳莉

1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226006；

2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 南通 226006；

3.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院傳染科，江蘇 南通 226006；

4.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，江蘇 南通 226001

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而我國(guó)HCC的發(fā)病率明顯高于世界平均水平。深入研究HCC患者蛋白質(zhì)譜的變化對(duì)揭示其發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和致病機(jī)制具有重要意義。精氨酸酶(arginase，Arg)是肝臟鳥氨酸循環(huán)中的一個(gè)催化酶，Arg有兩個(gè)同工酶，分別為Arg-1和Arg-2。Arg-1在肝臟中有較高的活性，也稱為“肝型Arg”［1-2］。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)、蛋白印跡法(Western blot)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Arg-1在HCC及癌旁肝組織中的表達(dá)情況，探討其與HCC臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院2005年1月—2011年12月經(jīng)手術(shù)切除的HCC患者158例；均經(jīng)患者知情同意，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物等治療，手術(shù)標(biāo)本診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)。同時(shí)切取距腫瘤2～3 cm的癌旁肝組織。正常對(duì)照組為肝移植供體標(biāo)本19例，肝血管瘤10例、肝外傷2例，共31例正常肝標(biāo)本。組織常規(guī)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋以及4 μm切片、HE染色用于組織學(xué)觀察，確定HCC分級(jí)。取上述158例HCC患者中31例的癌組織及相應(yīng)癌旁肝組織新鮮標(biāo)本，和10例肝血管瘤及2例肝外傷患者手術(shù)切除的正常肝組織，液氮凍存?zhèn)溆?。本組HCC病例年齡19～81歲，平均年齡52.9歲；其中男性133例，女性25例。有詳細(xì)的臨床資料，包括血清AFP水平、HBsAg檢測(cè)結(jié)果和病理檢查相關(guān)結(jié)果。術(shù)后隨訪本組HCC患者至2012年10月，158例患者中共132例成功隨訪，隨訪時(shí)間為10個(gè)月～6年，隨訪頻率1次/2～3個(gè)月，其中67例術(shù)后復(fù)發(fā)，65例無(wú)復(fù)發(fā)；隨訪方法采用門診復(fù)診和電話隨訪；隨訪內(nèi)容包括一般情況、AFP、肝臟B超或CT等。HCC復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：B超或CT發(fā)現(xiàn)肝臟實(shí)性占位，并參考同期AFP檢測(cè) 水平。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Arg-1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由美國(guó)Invitrogen公司合成，兔抗人Arg-1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，小鼠β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗及免疫組化試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA制備及逆轉(zhuǎn)錄

按TRIzol說(shuō)明書抽提肝組織總RNA。按每50 mg組織加入1 mL TRIzol進(jìn)行抽提。紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度并將所有樣本濃度調(diào)整為 1 μg/μL，立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。每個(gè)樣本取 1 μL作逆轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。合成好的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RT-PCR

Arg-1上、下游引物5’-AGGGTCCACCC T G AT C T T G G A G T-3’和5’-G G A G A ATCCTGGCACATCGGGA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度 1 5 3 b p；G A P D H 上下游引物5’-C C A TTTGCAGTGGCAAAG-3’，5’-CACCC CATTTGATGTTAGTG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度202 bp，按TaKaRa試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。每個(gè)樣本設(shè)3復(fù)孔。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加入2.5%核酸染料瓊脂糖凝膠中，以80 V/cm電壓電泳50 min，在紫外線下可見(jiàn)相應(yīng)長(zhǎng)度的目的基因和內(nèi)參的擴(kuò)增條帶，將電泳結(jié)果直接置于凝膠分析系統(tǒng)中對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.3.3 Western blot分析檢測(cè)

在新鮮HCC組織及相應(yīng)癌旁肝組織和正常肝組織中加入蛋白裂解液，冰浴勻漿，4 ℃離心，12 000×g離心20 min，取上清液，測(cè)定蛋白含量。分別取蛋白樣品各40 μg，加入4×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)上樣緩沖液，于沸水中加熱5 min，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，進(jìn)行濕式電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，用含10%脫脂奶粉的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸鹽緩沖液(trisaminomethanehydrochloric acid buffer saline and Tween，TBST)室溫包被2 h，第一抗體室溫溫育1 h后，4 ℃過(guò)夜。TBST漂洗5 min×5次，第二抗體室溫溫育2 h，TBST漂洗5 min×5次，化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL)發(fā)光，顯影，定影。吸光度(A)值測(cè)定用密度掃描儀(ZEISS全自動(dòng)圖像分析儀)測(cè)定目的條帶及β-actin的A值，以(A×S)/(a×s) (S和s分別表示條帶的面積)定義為Arg-1的A相對(duì)值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 組織芯片的制備

組織芯片由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系制作，主要步驟為：復(fù)閱所有HCC病例的HE切片，并在HE切片及原蠟塊上標(biāo)記所需組織的正確部位。將萊卡石蠟與蜂蠟按照2∶1比例混合，制成3.5 cm×2.2 cm×1.0 cm大小的空白蠟塊。在該蠟塊1.8 cm×1.2 cm范圍內(nèi)設(shè)計(jì)10×8點(diǎn)組織列陣，用組織芯片儀打孔制成模塊。用組織芯片儀直徑1.6 mm的吸針從供體蠟塊取組織，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的排列順序定位裝載在受體蠟塊中，并設(shè)置復(fù)點(diǎn)。

1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判定

所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后常規(guī)組織處理，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色。其中免疫組化染色參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PBS 液代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性的組織作陽(yáng)性對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師在不參考臨床病理資料的情況下進(jìn)行評(píng)定，實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞。綜合陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。將染色強(qiáng)度分為4級(jí)：無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比：＜5% 0分，5%～25% 1分，25%～50% 2分，50%～75% 3分，＞75% 4分；同時(shí)，兩者相乘再相加后取平均值，分為4個(gè)等級(jí)：陰性(-)：0～1；弱陽(yáng)性(+)：2～4；中度陽(yáng)性(++)：5～8；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：9～12。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)分析免疫組織化學(xué)結(jié)果，各組之間比較采用Spearman秩相關(guān)分析，率的比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Arg-1 mRNA在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中的表達(dá)水平

Arg-1 mRNA在正常肝組織、癌旁組織、HCC中均有一定的表達(dá)。在正常肝組織、癌旁組織中Arg-1 mRNA表達(dá)水平較高，在HCC組織中表達(dá)較弱，且隨HCC的分化程度的降低，其表達(dá)量隨之降低(圖1)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，正常肝組織中Arg-1的相對(duì)表達(dá)量為1.52±0.35；癌旁肝組織中相對(duì)表達(dá)量為1.03±0.34，HCC組織中相對(duì)表達(dá)量(高、中、低分化3組的平均 值)為0.41±0.31，HCC組織中Arg-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常肝組織和癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。HCC組織中Arg-1 mRNA的表達(dá)水平分別為：高分化HCC組織中的相對(duì)表達(dá)量0.70±0.25，中分化HCC中的相對(duì)表達(dá)量為0.41±0.30，低分化HCC中的相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.15，不同分化程度的HCC中Arg-1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 RT-PCR分析Arg-1 mRNA在正常肝組織、癌旁組織及HCC中的表達(dá)Fig. 1 RT-PCR analysis of Arg-1 mRNA expression in normal liver tissues, paracancerous liver tissues and HCC tissues

2.2 Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中的表達(dá)水平

Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中均有表達(dá)(圖2)。Arg-1蛋白在正常肝組織中表達(dá)量為2.11±0.26；HCC組織(高、中、低分化3組的平均值)為0.61±0.31，癌旁組織為1.61±0.26。HCC組織中Arg-1蛋白表達(dá)水平明顯低于正常肝組織和癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。HCC組織中Arg-1蛋白的表達(dá)水平分別為：高分化HCC為0.97±0.21；中分化HCC為0.64±0.21；低分化HCC為0.33±0.11，不同分化程度的HCC中Arg-1蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 Westen blot分析Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC中的表達(dá)Fig. 2 Western blot analysis of Arg-1 protein expression in normal liver tissues, paracancerous liver tissues and HCC tissues

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中的表達(dá)

運(yùn)用免疫組化法進(jìn)一步檢測(cè)了Arg-1蛋白在158對(duì)HCC及其癌旁組織、31例正常肝組織中的表達(dá)情況，顯示Arg-1蛋白在各組中均有表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核。Arg-1在正常肝組織和癌旁肝組織中普遍表達(dá)(圖3)，在HCC組織中表達(dá)低下或缺失(圖4)。Arg-1蛋白在158例HCC中弱陽(yáng)性表達(dá)63例，中度陽(yáng)性表達(dá)55例，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)21例，陽(yáng)性表達(dá)率為88%；158例癌旁組織中弱陽(yáng)性表達(dá)28例，中度陽(yáng)性表達(dá)68例，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)60例，陽(yáng)性表達(dá)率為98.7%；31例正常肝組織中中度陽(yáng)性表達(dá)7例，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)24例，陽(yáng)性表達(dá)率為100%。Arg-1蛋白在HCC組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(χ2=14.7416，P<0.01)和正常肝組織(χ2=4.1415，P<0.05)，癌旁組織和正常組織表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.3966，P>0.05，表1)。

2.4 Arg-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Arg-1蛋白表達(dá)水平隨HCC分化程度降低、脈管侵犯和術(shù)后復(fù)發(fā)而下降(P均<0.05)。Arg-1表達(dá)與HCC患者年齡、性別、HBsAg感染、血清AFP水平、有無(wú)肝硬化、腫瘤結(jié)節(jié)直徑、瘤結(jié)節(jié)數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性(表2)。

圖3 免疫組化檢測(cè)Arg-1蛋白在正常肝、癌旁肝組織及肝癌組織中的表達(dá)Fig. 3 Expression of Arg-1 protein in normal liver tissues, paracancerous liver tissues and HCC tissues by immunochemistry(EnVision, ×100)

圖4 HCC組織芯片中Arg-1的表達(dá)Fig. 4 Expression of Arg-1 protein in HCC tissue microarray

表1 Arg-1蛋白在HCC組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)Tab. 1 Expression of Arg-1 protein in HCC tissues, paracancerous liver tissues and normal liver tissues

表2 Arg-1表達(dá)與HCC患者臨床病理因素的關(guān)系Tab. 2 Correlation of Arg-1 expression with clinicopathological features of patients with hepatocellular carcinoma(n)

3 討 論

Arg是一種雙核錳金屬蛋白酶，含有332個(gè)氨基酸，它是三聚體結(jié)構(gòu)。內(nèi)源性的Arg從肝中生成并釋放。研究表明人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在兩種形式的Arg同工酶，分別為Arg-1和Arg-2，兩者的氨基酸序列大約有60%的同源相似性，主要的區(qū)別在于各自的組織分布、亞細(xì)胞定位以及免疫反應(yīng)性不同［1］。Arg-1其基因定位于6q23染色體，在肝臟中有較高的活性，也稱為“肝型Arg”，主要存在于門管區(qū)周圍的肝細(xì)胞中。它能水解L-精氨酸，生成尿素和L-鳥氨酸，除參與尿素循環(huán)外，還參與催化合成精胺和精脒等多種細(xì)胞生長(zhǎng)必需的代謝分子，因此，Arg-1的表達(dá)改變可能會(huì)導(dǎo)致肝組織代謝紊亂從而引發(fā)腫瘤，對(duì)細(xì)胞代謝水平和生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響。Arg-2也稱為“肝外Arg”，其基因定位于染色體14q24.1-24.3，主要在肝外組織中表達(dá)，如腦、腎、骨骼肌、小腸的線粒體，在肝臟內(nèi)也有微量的表達(dá)，它不參與尿素循環(huán)，主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)精氨酸的濃度，從而控制生物體內(nèi)一氧化氮(nitric oxide，NO)、脯氨酸、多胺等物質(zhì)的生物合成［2-4］。

本研究應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法，對(duì)Arg-1在HCC組織、癌旁肝組織及正常肝組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示Arg-1在HCC組織中的表達(dá)水平均明顯低于相應(yīng)癌旁肝組織及正常肝組織，這與先前的報(bào)道是一致 的［5］。提示Arg-1可能參與HCC的發(fā)生、發(fā)展，在HCC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到負(fù)性調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Arg-1在HCC中的表達(dá)較正常肝組織有明顯的降低和缺失，其陽(yáng)性表達(dá)率為88%，且與HCC的分化程度密切相關(guān)，隨著HCC的分化程度的降低，Arg-1表達(dá)率有下降的趨勢(shì)。并且，Arg-1的表達(dá)水平與血管侵犯和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，而與HCC患者年齡、性別、HBsAg感染、血清AFP水平、有無(wú)肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)均無(wú)關(guān)。這些結(jié)果提示，Arg-1可能在HCC的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中有著重要作用，Arg-1表達(dá)下降或缺失可能促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移。

先前的研究顯示，精氨酸對(duì)于肝癌、黑色素瘤和骨肉瘤等精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型惡性腫瘤細(xì)胞而言是必需氨基酸，在缺乏精氨酸的環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制［6-7］，一旦體外的精氨酸缺乏，或存在精氨酸降解酶以及消耗精氨酸的培養(yǎng)基的情況下，會(huì)導(dǎo)致多種癌細(xì)胞迅速出現(xiàn)摧毀結(jié)構(gòu)［8-9］。在精氨酸代謝過(guò)程中，Arg-1和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是兩個(gè)極其關(guān)鍵的酶，精氨酸可被Arg-1催化轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸而自身耗竭掉，另外Arg-1也可代謝精氨酸，參與尿酸、多氨的合成，后者是細(xì)胞增殖的必需物質(zhì)之一。Arg-1的最終結(jié)果是抑制精氨酸向NO的衍生，Arg-1表達(dá)下降可使精氨酸蓄積，從而間接導(dǎo)致iNOS底物相對(duì)增多，生成NO增加，其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有直接作用［10］。其機(jī)制可能包括：①NO可引起DNA鏈的斷裂，抑制DNA修復(fù)酶的修復(fù)作用［11-12］；②NO可使部分抑癌基因，如p53基因產(chǎn)生不可逆的損傷，使抑癌基因失活［11-12］；③NO促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡而有利于生長(zhǎng)停止的腫瘤細(xì)胞的存活［13］；④NO具有促進(jìn)腫瘤血管形成的作用，還介導(dǎo)腫瘤血管的舒張作用，維持腫瘤的血流量，使腫瘤的微血管通透性增加［14］，作為內(nèi)源性血管舒張因子的NO，對(duì)血管及腫瘤微循環(huán)的確立起直接作用，同時(shí)，NO通過(guò)上調(diào)其介導(dǎo)的血管生成因子—血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活性來(lái)促進(jìn)新血管的生成［15］；⑤促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。NO可以通過(guò)影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)而增強(qiáng)腫瘤的侵襲力［16］。結(jié)合本研究結(jié)果，我們考慮Arg-1在HCC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到負(fù)性調(diào)控作用，Arg-1表達(dá)下降可能導(dǎo)致精氨酸在HCC中的聚集，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；或者導(dǎo)致iNOS底物相對(duì)增多，生成NO增加，進(jìn)而促進(jìn)HCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

另外，還有研究表明，精氨酸是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和增殖的必需氨基酸之一，細(xì)胞外的精氨酸被Arg-1水解后，T細(xì)胞CD3ζ鏈表達(dá)受到影響，進(jìn)而抑制T細(xì)胞增殖，最終影響對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制功能［17-18］。Arg-1還能夠激活腫瘤誘導(dǎo)的骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derive suppressor cells，MDSCs)，MDSCs存在于幾乎所有癌癥患者的外周血中，主要發(fā)揮免疫抑制作用，介導(dǎo)癌癥患者系統(tǒng)性免疫功能障礙和局部的腫瘤免疫逃避［19］。Arg-1在HCC中的異常表達(dá)是否通過(guò)介導(dǎo)機(jī)體免疫抑制而影響HCC的發(fā)生、發(fā)展，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。總之，Arg-1能通過(guò)多種途徑影響腫瘤的進(jìn)展，但具體通過(guò)何種機(jī)制參與HCC還有待進(jìn)一步 研究。

本研究應(yīng)用RT-PCR和Western blot以及免疫組織化學(xué)技術(shù)等，從mRNA和蛋白水平初步探討了Arg-1在HCC中的表達(dá)和意義以及可能的作用機(jī)制。明確Arg-1在HCC中的作用及具體機(jī)制，將有助于更深入認(rèn)識(shí)HCC，也為臨床尋找有效的治療靶點(diǎn)提供新的依據(jù)。

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