常染色體顯性遺傳ALPORT綜合征一家系COL4A3及COL4A4的基因突變*

束雙雙，張連云，黃艷梅，張 晶，楊保勝，咸 韋

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學院法醫(yī)物證學教研室 新鄉(xiāng)453003 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 新鄉(xiāng)453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科新鄉(xiāng)453003

Alport 綜合征(Alport syndrome，AS)又稱遺傳性腎炎，是一種主要累及腎臟的遺傳病。臨床上AS主要表現(xiàn)為患者反復血尿、蛋白尿以及進行性腎功能衰退，可伴有眼部疾病和感音神經(jīng)性耳聾等腎外表現(xiàn)。目前認為AS 的發(fā)病機制與編碼腎小球基底膜上Ⅳ型膠原α3、α4 和α5 鏈的基因突變有關(guān)，且具有遺傳異質(zhì)性。其中，編碼α5 鏈的COL4A5 基因突變可導致性連鎖AS(XLAS，約占85%);編碼α3和α4 鏈的COL4A3 及COL4A4 基因突變可導致常染色體隱性AS(ARAS，約占14%)和常染色體顯性AS(ADAS，約占1%)［1-2］。國內(nèi)關(guān)于ADAS 相關(guān)基因突變的報道較少。該研究對一ADAS 家系的COL4A3/COL4A4 基因突變進行了分析。

1 對象與方法

1．1 研究對象 先證者(Ⅲ5)，男，21歲，聽力下降6 a 余，以“顏面浮腫半個月”為主訴入院，半個月前受涼后出現(xiàn)咳嗽、咳痰。檢查示，尿紅細胞90～100/HP，異性紅細胞比例＞60%，為腎小球源性血尿;24 h 尿蛋白定量5 g。血肌酐146 μmol/L，尿素氮8．64 mmol/L。彩超示雙腎彌漫性損傷。電測聽檢查雙耳為中度神經(jīng)性耳聾。腎活檢病理組織學檢查示腎小球系膜細胞和基質(zhì)輕至中度彌漫性增生，腎小管上皮細胞灶狀萎縮，腎間質(zhì)多灶狀淋巴細胞和單核細胞浸潤伴纖維化。電鏡下可見GBM 不規(guī)則增厚，節(jié)段GBM 變薄，致密層分裂，伴不規(guī)則內(nèi)外側(cè)緣，呈“花籃狀”改變，其中可見“電子致密顆粒”。腎活檢組織(圖1)Ⅳ型膠原抗α3、α4 羥基端非膠原區(qū)抗體免疫熒光染色為陰性。該患者AS 診斷明確。

圖1 正常人(A)及先證者(B)腎臟基底膜Ⅳ型膠原α 鏈(免疫熒光，×400)

1．2 家系調(diào)查 對該家系成員進行詳細調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、性別、腎功能指標以及聽覺和視覺，繪制系譜圖(圖2)。該家系無近親結(jié)婚史，根據(jù)系譜分析符合常染色體顯性遺傳。在該家系成員中，Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 有不同程度的鏡下血尿，均為腎小球源性。Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 出現(xiàn)蛋白尿;Ⅱ7、Ⅲ3 有輕度的神經(jīng)性耳聾，先證者Ⅲ5 出現(xiàn)了腎功能衰竭，Ⅱ7、Ⅲ3 處于腎功能代償期(表1)。Ⅰ1 50歲、Ⅱ3 38歲因腎功能衰竭死亡，Ⅱ1 及Ⅱ4 均有長期血尿史。

圖2 一ADAs 家系系譜圖

表1 一ADAs 家系臨床資料

1．3 全基因組DNA 的提取 知情同意后，采集河南漢族一常染色體顯性遺傳Alport 綜合征家系成員12 人外周靜脈血，其中男7 人(Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ2)，女5 人(Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅳ1)。另取50 名健康人外周靜脈血作為對照。所有血樣本采用有機酚-氯仿法提取基因組DNA。

1．4 PCR擴增及測序參照文獻［3-4］，根 據(jù)COL4A3/COL4A4 基因各外顯子臨近區(qū)域的內(nèi)含子序列，合成上、下游引物序列。擴增體系25 μL，其中含10 ×Buffer 2．5 μL，2．0 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 正反引物各1 μL，DNA Taq 酶1 U，100 mg/L DNA 模版3 μL，ddH2O 16．1 μL。反應條件:95℃預變性2 min;94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，32個循環(huán);72℃再延伸10 min。擴增后經(jīng)60 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，由美國Invitrogen 公司進行雙向測序。分析測序結(jié)果并與健康人及GenBank 中序列進行比較。

2 結(jié)果

對先證者及該家系中患病者COL4A3/COL4A4基因外顯子進行測序，并與50 名健康人測序結(jié)果及GenBank 序列進行對比分析，共篩選出COL4A3/COL4A4 基因8個突變位點，其中包括1個錯義突變、1個內(nèi)含子突變和6個序列變異。見表2、圖3。

圖3 COL4A3/COL4A4 基因測序結(jié)果

COL4A4 基因第44 外顯子的錯義突變c．4195 A ＞T 導致M1399L，該家系有癥狀的患者(Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5)均出現(xiàn)了此突變，均表現(xiàn)為雜合子，而作為對照的50 名健康人以及該家系表現(xiàn)正常者中未出現(xiàn)此突變。先證者Ⅲ5 第44 內(nèi)含子上出現(xiàn)c．4127+11 C ＞T 突變，其他家系成員未見此突變。

3 討論

ADAS 通常是由COL4A3 和(或)COL4A4 基因突變引起，這些基因定位于2q35～q37，分別編碼構(gòu)成Ⅳ型膠原的α3 及α4 鏈。COL4A3 及COL4A4 基因突變可導致α3 及α4 鏈的異常，引起Ⅳ型膠原分子結(jié)構(gòu)的改變和功能的缺陷，進而影響腎臟基底膜的正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［5］。目前25%～50% AS 的突變?yōu)楦拾彼崛〈蛔?，甘氨酸被認為是最小的氨基酸，可以插入Ⅳ型膠原緊密的三螺旋內(nèi)部，它的取代突變可破壞螺旋的形成，進而影響基底膜的結(jié)構(gòu)而導致疾病。ADAS 的常見突變包括甘氨酸取代突變、錯義突變、剪接位點突變等，但無明顯的突變熱點［6］。

該研究發(fā)現(xiàn)位于COL4A4 基因第44 外顯子上的錯義突變c．4195 A ＞T，導致α4 鏈第1 399個氨基酸由甲硫氨酸替換為亮氨酸(M1399L)，該突變尚未見報道。該家系中凡是有血尿、蛋白尿的患者均出現(xiàn)此突變，表現(xiàn)為雜合子。先證者的母親(Ⅱ2)無臨床表現(xiàn)，基因檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常，50 名健康人也未檢測到此突變。推測此突變可能為該家系的致病突變位點，這與文獻［7］報道的常見的甘氨酸取代突變有所不同。該突變可能影響了膠原鏈的組裝，但具體機制有待于進一步研究。

該家系中亦發(fā)現(xiàn)了一個尚未報道的內(nèi)含子突變c．4127 +11 C ＞T，該突變僅出現(xiàn)于先證者COL4A4基因上，先證者在該家系存活者中病情最嚴重，已出現(xiàn)腎功能衰竭。由于該突變未出現(xiàn)在剪接位點，先證者病情嚴重程度是否與該突變有關(guān)尚不清楚。該研究中作者發(fā)現(xiàn)COL4A3/COL4A4 基因上有3個同義突變和3個錯義突變。文獻［8-10］報道以上6個序列變異為多態(tài)性位點，這些基因的多態(tài)性是否也導致了Ⅳ膠原鏈形成的異常并引起AS 還有待于進一步研究。

研究［11］表明ADAS 具有遺傳多源性。該家系中同樣具有雜合突變的Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5，其臨床表現(xiàn)嚴重程度不一，蛋白尿、血尿的程度不一，表型和基因型的關(guān)系不明確，推測可能與其他染色體上的基因突變有關(guān)，需進一步研究。

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