他克莫司對IgA腎病模型大鼠腎臟的影響

劉寶玲 劉 冰 陳 志 孫珉丹 (一汽總醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 長春 300)

IgA腎病是以IgA沉積為主，伴或不伴IgG、IgM及C3沉積為特征的一類腎小球腎炎，是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的最常見的原發(fā)性腎小球疾病之一〔1〕。他克莫司(普樂可復(fù))是一種新型高效的免疫抑制劑，主要治療器官移植后的抗排斥反應(yīng)〔2〕以及自身免疫性疾病，有關(guān)其在腎病領(lǐng)域的研究主要集中在狼瘡性腎炎〔3〕及早期膜性腎病。本實驗探討牛血清白蛋白(BSA)聯(lián)合脂多糖(LPS)制備IgA腎病模型大鼠及普樂可復(fù)防治IgA腎病的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級6周齡雄性Wistar大鼠50只，體重(200±20)g，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗室。所有大鼠實驗前尿紅細(xì)胞計數(shù)及尿蛋白定性試驗均呈陰性(尿沉渣計數(shù)法、試紙條法)，排除動物因素對實驗結(jié)果的影響。

1.2 材料及主要儀器 BSA來自瑞典進(jìn)口分裝，LPS為美國Sigma公司產(chǎn)品，四氯化碳(CCl4)及蓖麻油購自天津化學(xué)試劑廠，普樂可復(fù)出自 Astellas Ireland Co.，Ltd.Killorglin，Co.Kerry，貝那普利由北京諾華制藥有限公司惠贈。SP免疫組化試劑盒、AEC顯色試劑盒及DAB顯色試劑盒均由福州邁新生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司，型號BX51。

1.3 動物分組、IgA腎病模型的制備以及給藥方法 大鼠隨機(jī)分為正常對照組10只，造模組40只。正常對照組從實驗開始第1天起給予4 ml/kg的蒸餾水隔日灌胃1次，共8 w;皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.4 ml/只，每周1次，持續(xù)9 w;于第6周經(jīng)尾靜脈注射0.9%NaCl 0.2 ml/只。第10周起，給予4 ml·kg-1·d-1蒸餾水灌胃，1次/d。IgA腎病模型制備根據(jù)陸慧渝等〔4〕方法及預(yù)實驗結(jié)果，將BSA以蒸餾水配成100 g/L的濃度，從實驗第1天開始以 BSA 400 mg/kg灌胃，隔日1次，共8 w;皮下注射 CCl40.1 ml+蓖麻油 0.3 ml，1 次/d，共 9 w;于第6周尾靜脈注射LPS 0.05 mg/只。第9周隨機(jī)選取造模組8只及正常對照組2只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠取腎組織經(jīng)蘇木素伊紅染色(HE)及免疫組化觀察證實IgA腎病造模成功后隨機(jī)分為4組，每組8只。自第9周起，正常對照組給予4 ml·kg-1·d-1蒸餾水灌胃，1次/d;模型組給予蒸餾水4 ml·kg-1·d-1灌胃，1次/d;貝那普利組給予貝那普利 10 mg·kg·d-1，每日灌胃1次;普樂可復(fù)組給予普樂可復(fù)4 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次。貝那普利+普樂可復(fù)組:以普樂可復(fù)4 mg·kg-1·d-1+貝那普利10 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次;以上各組均持續(xù)至12 w末，以10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，無菌操作下摘除左腎，切取部分腎組織，置于10%甲醛中固定做光鏡檢查及免疫組織化學(xué)檢查。

1.4 常規(guī)HE染色 將留取的大鼠腎組織置于4%中性甲醛固定液中固定48 h，常規(guī)脫水，透明，包埋，將蠟塊切成2～3 μm的切片，進(jìn)行HE染色，主要觀察腎組織內(nèi)的細(xì)胞成分和形態(tài)特點。光鏡下觀察腎組織病理改變，攝片。

1.5 SP免疫組織化學(xué)方法檢測IgA的定位和表達(dá) 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，自來水沖洗，蒸餾水沖洗。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min。每張切片滴加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加非免疫動物血清，室溫下孵育10 min。滴加兔抗大鼠IgA抗體(1∶200)于組織切片上，4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體于組織切片上，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加鏈霉素抗生物-過氧化物酶溶液于組織切片上，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加AEC顯色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)于切片上，顯微鏡下觀察至顯色滿意，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，流水沖洗反藍(lán)。水性封片劑封片，顯微鏡下觀察攝影。

2 結(jié)果

2.1 光鏡組織學(xué)改變 光鏡下可見正常對照組腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)無增生，毛細(xì)血管襻開放良好，腎小球無萎縮，腎小管結(jié)構(gòu)基本規(guī)則，未見間質(zhì)增生及炎細(xì)胞浸潤;模型組多數(shù)腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)彌漫性中度增生，腎小球基底膜節(jié)段性增厚，腎小球內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤，偶見球囊粘連和節(jié)段硬化，毛細(xì)血管管壁增厚，管腔中度狹窄，腎小管間質(zhì)有較多炎細(xì)胞浸潤，部分腎小管擴(kuò)張，灶狀腎小管萎縮;貝那普利組、普樂可復(fù)組腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度彌漫增生，腎小球內(nèi)偶見炎細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管管腔輕度狹窄，腎小管間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤，腎小管管腔部分開放尚好。貝那普利+普樂可復(fù)組腎小球毛細(xì)血管襻開放尚好，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度彌漫增生，腎小球基底膜未見明顯增厚，腎小球內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)偶見炎細(xì)胞浸潤，腎小管小灶狀輕度萎縮，偶見管型(見圖1)。

2.2 免疫組組織化學(xué)法測定IgA表達(dá) 顯微鏡下可見除正常對照組外，各組大鼠腎小球系膜區(qū)和毛細(xì)血管棕黃色顆粒狀及團(tuán)塊狀的沉積，提示IgA腎病造模成功;模型組可見腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管襻棕黃色強(qiáng)陽性染色區(qū)，個別呈團(tuán)塊狀;各治療組腎小球系膜區(qū)內(nèi)IgA棕黃色強(qiáng)度較模型組稍弱，以貝那普利組+普樂可復(fù)組強(qiáng)度最弱(見圖2)。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色(×400)

圖2 各組大鼠腎臟組織IgA沉積強(qiáng)度(×400)

3 討論

Berger等〔5〕首先報道了 IgA腎病，隨后國內(nèi)外眾多學(xué)者〔6〕通過對其發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、病理與臨床、治療及預(yù)后等方面的深入研究，認(rèn)為主要是IgA為主的免疫復(fù)合物，伴或不伴IgG、IgM及C3，在腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)沉積，激活多種細(xì)胞因子及促發(fā)免疫反應(yīng)過程，從而導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化，最終引起腎衰竭。因此，如何抑制系膜基質(zhì)沉積是延緩IgA腎病進(jìn)展、改善預(yù)后的關(guān)鍵所在，也是治療的靶點之一。

普樂可復(fù)是一種新型高效的免疫抑制劑，已應(yīng)用于臨床多種器官移植，免疫抑制效果良好〔7，8〕，主要是通過抑制 T細(xì)胞活化以及Th輔助細(xì)胞依賴型B細(xì)胞增生及抑制細(xì)胞因子IL-1～4、9、10等及干擾素(IFN)-γ的生成及 IL-2R的表達(dá)，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)〔9～11〕，其抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力較環(huán)孢素A大10～100倍〔12〕。在分子水平，普樂可復(fù)與T細(xì)胞內(nèi)特異性受體蛋白(胞質(zhì)結(jié)合蛋白-FKBP12)結(jié)合，形成復(fù)合物(普樂可復(fù)-FKBP12)，競爭性抑制普樂可復(fù)與鈣調(diào)素的結(jié)合，使鈣調(diào)素介導(dǎo)的信號傳遞系統(tǒng)受到抑制，阻斷IL-2轉(zhuǎn)錄及抑制T細(xì)胞活化，從而發(fā)揮免疫抑制作用〔13〕。

1 王海燕.腎臟病學(xué)〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:993.

2 Pirsch JD.FK506 Kidney Transplant study group.A comparison of tacrolimus(FK506)and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation〔J〕.Transplantation，1997;15;63(7):977-83.

3 陳 強(qiáng)，劉志紅，胡偉新，等.普樂可復(fù)治療Ⅳ型狼瘡性腎炎的前瞻性臨床研究〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，2002;11(4):301-6.

4 陸慧渝，張巧玲，蔣小云，等.IgA腎病大鼠模型的建立〔J〕，中國誤診學(xué)雜志，2011;11(6):1264-7.

5 Berger J，Hingais N.Intercapillary depsits of IgA-IgG〔J〕.J Urol Nephrol(Paris)，1968;74(9):694-5.

6 余英豪，鄭智勇，姚麗清.腎穿刺活檢病理診斷彩色圖譜〔M〕.福建:福建科學(xué)技術(shù)出版社，2008:63-721.

7 Starzl TE，Todo S，F(xiàn)ung J，et al.FK506 for liver，kidney and pancreas transplantation〔J〕.Lancet，1989;2:1000-4.

8 Pirsch JD.FK506 kidney Transplant Study Group.A comparison of tacrolimus(FK506)and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation〔J〕.Transplantation，1997;63(7):977-83.

9 Dumont FJ.FK506，an immunosuppressant targeting calcineurin function〔J〕.Curr Med Chem，2000;7(7):731-48.

10 Denys A，Allain F，Masy E，et al.Enhancing the effect of secreted cyclophilin B on immunosuppressive activity of cyclosporine〔J〕.Transplantation，1998;65(8):1076-84.

11 Unere NA，Stevenson P，Schafer A.Pharmacokinetics of tacrolimus:clinically relevant aspects〔J〕.Transplant Proc，1999;31(7A):21S-4.

12 Hutchinson IV.The mode of action of prograf(tacrolimus)and its significance for long term graft survival〔J〕.New Horizons Kidney Transpl，1997;12(1):22-6.

13 傅 鵬，于 光，許 靜，等.來氟米特聯(lián)合激素延緩進(jìn)展型IgA腎病腎功能減退的臨床研究〔J〕.臨床內(nèi)科雜志，2006;23(11):731-3.