逍遙散對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA1區(qū)及前額葉超微結(jié)構(gòu)的影響

趙唯賢 郭梅珍 王保偉 劉建濤 李高申 李宜培 劉俊玲

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 451141)

阿爾茨海默病(AD)早期常表現(xiàn)為典型的抑郁癥狀和對(duì)日常興趣的喪失，記憶力減退，智力下降，意念消極，性格改變等〔1，2〕。本研究從疏肝立法，通過(guò)對(duì)大鼠海馬及前額葉超微結(jié)構(gòu)的觀察，探討疏肝理氣方劑對(duì)改善AD病指標(biāo)的相關(guān)性，旨在為AD臨床提供治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)4～5個(gè)月SD雄性大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXX(豫)2010-0002。

1.1.2 干預(yù)藥物

1.1.2.1 中藥制備 逍遙散(組成:柴胡、當(dāng)歸、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷)各藥間質(zhì)量按 10 ∶10 ∶10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1配比，由我院科研處按中藥煎劑制備流程自行制作。于每日用藥前2 h開(kāi)始即時(shí)配制，最后將藥液濃縮至2 g/ml，備用。

1.1.2.2 西藥制備 將奧拉西坦藥粉(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司提供，400 mg/粒，批號(hào):05110703)在每日用藥前30 min用常溫蒸餾水稀釋成濃度為150 mg/ml的奧拉西坦溶液，備用。

1.1.3 試劑設(shè)備 D-半乳糖 (D-gal，Genview公司產(chǎn)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司分裝，批號(hào):22L10133);β淀粉樣多肽 (Aβ)1～42peptide(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào):990901);潔凈工作臺(tái) (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);大腦立體定位儀 (安徽淮北正華單臂立體定位儀);超薄切片機(jī) (型號(hào) LKBV)、透射電鏡 (日本電子，JEM-1400)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，6只/籠，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00 ～18∶00)，室溫 22℃ ～24℃，濕度 30% ～ 40%，自由飲水進(jìn)食。喂以普通大鼠顆粒飼料(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。使用苦味酸染色對(duì)每只大鼠進(jìn)行標(biāo)號(hào)。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)，留用成績(jī)最優(yōu)者作為正式實(shí)驗(yàn)用大鼠，并隨機(jī)分為生理組、模型組、西藥組、中藥組，每組10只。

1.2.2 試劑配制 ①事先將1 mg Aβ1～42加入200 μl生理鹽水(5 μg/ul)，震蕩混勻使其充分溶解，用封口膜密封，放入37℃溫箱孵育1 w，孵育后可放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?②D-gal用生理鹽水稀釋成10 g/L溶液，在使用前30 min臨時(shí)配制。

1.2.3 模型制作 模型、西藥、中藥三組采用D-gal腹腔注射和 Aβ1～42peptide雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造?！?〕:大鼠經(jīng)10%水合氯醛 (0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定在大腦立體定位儀上，剪短頭部毛發(fā)，切開(kāi)頭皮暴露頭骨。以前囟為基點(diǎn)，將微量注射器針頭對(duì)準(zhǔn)前囟中央，針頭后移4 mm，左右各移2 mm分別為左右側(cè)海馬位置。鉆開(kāi)頭骨，用微量注射器針頭進(jìn)入大腦1.6 mm到達(dá)海馬組織。每側(cè)海馬組織在10 min內(nèi)緩慢注射10 μg(2 μl)孵育好的A-B溶液，每側(cè)注射后將針頭留置10 min，以免溶液外溢。注射完畢用骨蠟封閉針孔，縫皮、消毒，腹腔注射20萬(wàn)IU青霉素以防感染。生理組僅用等體積滅菌生理鹽水如前各組操作象征性造模。

1.2.4 藥物干預(yù) 各組均在造模完成后的次日開(kāi)始。生理、模型組分別采用生理鹽水0.5 ml/100 g灌胃;西藥、中藥組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃，劑量均為0.5 ml/100 g。四組均連續(xù)灌胃干預(yù)28 d，灌胃1次/d。

1.2.5 標(biāo)本取材 干預(yù)結(jié)束后，大鼠以0.4 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉液腹腔注射麻醉，斷頭處死，在滴有4℃ 4%戊二醛固定液的蠟板上 (蠟板放置在冰盒上)，迅速用刀片從正中剖開(kāi)大腦，取出海馬CA1區(qū)及前額葉組織，同時(shí)用注射器抽取4℃ 4%戊二醛固定液反復(fù)沖洗分離的組織1～2 min，使其固定，再迅速切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，分組標(biāo)記，放入裝有4℃ 4%戊二醛固定液的小玻璃容器中，4℃保存、待檢。

2 結(jié)果

電鏡圖片顯示:生理組大鼠前額葉皮質(zhì)(PFC)神經(jīng)元細(xì)胞核居中，核仁明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在胞質(zhì)聚集成片，微管、微絲排列整齊，模型組大鼠PFC神經(jīng)元可見(jiàn)大量線粒體腫脹、其嵴消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核膜皺褶，微管、微絲排列紊亂、纏結(jié);突觸間隙明顯變寬、突觸后膜致密物(PSD)厚度明顯變薄。中藥組及西藥組大鼠PFC神經(jīng)元微量線粒體腫脹，少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，微管、微絲排列較有序。與模型組大鼠比較，中藥組大鼠PFC神經(jīng)元突觸間隙明顯變窄、PSD厚度明顯變厚。見(jiàn)圖1。

圖1 電鏡觀察各組海馬CA1區(qū)、額葉區(qū)超微結(jié)構(gòu)

3 討論

AD的病理學(xué)特征是在腦內(nèi)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)和大量的老年斑等，神經(jīng)原纖維纏結(jié)的主要成分是異常過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau，老年斑的主要成分是Aβ〔4〕。在老年斑形成之前，有神經(jīng)毒性的可溶性Aβ寡聚體可造成腦內(nèi)突觸損害〔5〕。線粒體等細(xì)胞器及突觸等超微結(jié)構(gòu)變化也是AD認(rèn)知功能障礙的重要病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)〔6～8〕。

正常情況下Aβ的產(chǎn)生和降解保持平衡，其從可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉(zhuǎn)變是AD發(fā)病的關(guān)鍵。Aβ的分子構(gòu)型與Aβ神經(jīng)毒性關(guān)系密切，β片層結(jié)構(gòu)可促進(jìn)Aβ聚集成不溶性纖維，形成極難溶的沉淀(斑塊)，導(dǎo)致AD發(fā)生〔9〕。

學(xué)習(xí)記憶過(guò)程涉及多個(gè)腦區(qū)的功能活動(dòng)，在人類，PFC與情緒之間有密切關(guān)系，臨床和神經(jīng)成像研究結(jié)果顯示，PFC損傷對(duì)情緒行為會(huì)造成一定的影響〔10〕。PFC是大腦新皮質(zhì)中起重要聯(lián)絡(luò)作用的一個(gè)區(qū)域，參與了學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程〔11〕。有學(xué)者推測(cè)PFC在前瞻性記憶的編碼、保持、提取和執(zhí)行的過(guò)程中可能起著重要作用〔12〕。有研究顯示，小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力下降同時(shí)出現(xiàn)海馬CA1區(qū)突觸前后膜不清晰，間隙消失，小泡數(shù)目減少，部分線粒體腫脹變性，嵴斷裂，推測(cè)這些超微結(jié)構(gòu)的變化可能是早期學(xué)習(xí)記憶行為障礙的形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一〔13〕。

本研究顯示，逍遙散對(duì)AD模型大鼠CA1區(qū)及PFC神經(jīng)元損傷的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，微管、微絲的排列紊亂有一定的調(diào)整作用，能降低AD模型腦內(nèi)Aβ水平，進(jìn)而減低了Aβ對(duì)大鼠海馬的毒性作用。文獻(xiàn)〔14〕報(bào)道，突觸間隙變窄，PSD變厚等均能增強(qiáng)突觸傳遞效能。逍遙散能使AD模型大鼠突觸間隙變窄，PSD厚度變厚，增強(qiáng)突觸傳遞效能，改善AD模型大鼠受損的學(xué)習(xí)記憶能力。

AD屬中醫(yī)的“呆病”、“郁證”范疇，中醫(yī)對(duì)其病因有獨(dú)特的理論，認(rèn)為是一種全身性疾病，病位在腦，但與五臟具有關(guān)系，其中腎、脾、心、肝四臟關(guān)系最為密切。七情失調(diào)是本病形成的重要原因，當(dāng)今社會(huì)中如精神創(chuàng)傷，情緒壓抑;或獨(dú)身居住、子女不孝;或離異喪偶、孤獨(dú)寂寞等都可作為現(xiàn)場(chǎng)情志失調(diào)的重要因素。而肝主疏泄，調(diào)暢情志，對(duì)情志的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。早期AD常表現(xiàn)為典型抑郁癥狀和對(duì)日?；顒?dòng)的興趣喪失。AD的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害老年人的身心健康和生活質(zhì)量，并給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，已成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，應(yīng)引起政府和醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注，加強(qiáng)這方面的研究。

1 方凌燕，劉衍宇，關(guān)俊文，等.阿爾茨海默病與生物節(jié)律相互關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(8):1486-8.

2 黃東明，呂澤平，覃少東，等.阿爾茨海默病尿酸水平相關(guān)性研究〔J〕.廣西醫(yī)學(xué)，2012;34(11):1483-5.

3 李 林，茹立強(qiáng).D-半乳糖-Aβ復(fù)合造模致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙及丹參酮治療作用的研究〔J〕.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009;49(1):13-6.

4 Kosuga S，Tashiro E，Kajioka T.GSK-3 beta directly phosphorylates and activates MARK2/PAR-1〔J〕.J Biol Chem，2005;52:42715-22.

5 Townsend M，Shankar GM，Mehta T，et al.Effects of secreted oligomers of amyloid β-protein on hippocampal synaptis plasticity:a potent role for tri-mers〔J〕.J Physiol，2006;572(2):477-92.

6 鮑 娟，楊期東，羅紅波，等.Aβ1-42注射后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)變化的研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008;8(2):246-8，266.

7 孔令平，劉 妍，魏桂芬，等.阿爾茨海默病胞質(zhì)雜交細(xì)胞的構(gòu)建與其線粒體的結(jié)構(gòu)功能變化〔J〕.解剖學(xué)雜志，2013;36(3):365-8.

8 崔玉環(huán)，張朝東，魏玉磊，等.線粒體與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2010;9(1):89-92.

9 Wang H，Dey D，Carrera I，et al.COPS5(Jab1)Protein increases β site processing of amyloid precursor protein and amyloid β peptide generation by stabilizing ranBP9 protein levels〔J〕.J Biol Chem，2013;288(37):26668-77.

10 王一牛，羅躍嘉.前額葉皮質(zhì)損傷患者的情緒異常〔J〕.心理科學(xué)進(jìn)展，2004;12(2):161-7.

11 謝 敏，徐 波，王澤軍.游泳訓(xùn)練對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力與海馬、前額葉皮質(zhì)環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷水平的影響〔J〕.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009;24(11):1002-5.

12 程懷東，汪 凱，牛朝詩(shī)，等.前額葉損傷患者基于事件和基于時(shí)間的前瞻性記憶損害〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2006;39(12):818-21.

13 薛衛(wèi)國(guó)，葛桂玲，張 忠，等.電針對(duì)轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.針刺研究，2009;34(5):309-14.

14 范新六，李 峰，宋月晗，等.加味四逆散對(duì)異相睡眠剝奪大鼠前額葉皮質(zhì)突觸可塑性改變的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011;17(19):126-8.