穩(wěn)心顆粒劑在大鼠心肌缺血再灌注損傷時對冠脈內(nèi)皮細胞的影響

王 多 劉艷萍 劉 全 (一汽總醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長春 300)

近年來隨著再灌注治療方法的建立和推廣，心肌的缺血再灌注損傷十分常見。多年來的研究表明，內(nèi)皮細胞損傷是缺血再灌注損傷的主要機制，其盡管不是心肌梗死的起因，但其功能的受損卻加重了梗死區(qū)的擴大及心功能的惡化。因此，采取一系列方法保護內(nèi)皮細胞成為減輕缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。穩(wěn)心顆粒是一種中成藥，主要成分有黨參、黃精、三七、甘松，臨床主要用于治療心律失常，有關(guān)穩(wěn)心顆粒對血管內(nèi)皮特別是冠脈內(nèi)皮影響的動物實驗及進一步研究未見相似報道。本研究擬探討在心肌缺血再灌注損傷時穩(wěn)心顆粒對冠脈內(nèi)皮細胞的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和造模 健康體重約為220～280 g雌雄各半的SD大鼠160只(符合國家動物協(xié)會實驗動物標(biāo)準(zhǔn))，隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、穩(wěn)心顆粒大劑量組和穩(wěn)心顆粒小劑量組。在缺血再灌注模型建立前4天，假手術(shù)組和缺血再灌注組每只每日給予生理鹽水(1.0 ml/100 g)灌胃，穩(wěn)心顆粒大劑量組和穩(wěn)心顆粒小劑量組分別每日給予生理鹽水稀釋的穩(wěn)心顆粒18 g/kg，9 g/kg灌胃。以上四組大鼠在實驗前1 h再進行1次灌胃。每組隨機分成兩個亞組，一組腹主動脈采血檢測血清一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，另一組做電鏡標(biāo)本。缺血再灌注組和兩組給藥組將大鼠用乙醚吸入麻醉后固定在手術(shù)臺上，沿正中線剪開其胸前的皮膚，在大鼠左前胸第4、5肋間用止血鉗撥開，暴露心臟，在左冠狀動脈近端下穿3-0號縫線結(jié)扎左冠狀動脈(縫線打活結(jié))，隨后關(guān)胸，1 h后松開縫線再灌注6 h，之后用5%戊巴比妥鈉(1 ml/100 mg)腹腔麻醉后，開腹在腹主動脈采血。并打開胸廓，將心臟全部取出，在結(jié)扎線下取心肌組織，置于4%戊二醛溶液中固定，按常規(guī)方法制作電鏡標(biāo)本。假手術(shù)組手術(shù)方法同上，但不結(jié)扎左冠狀動脈。

1.2 生化指標(biāo)測定 取全血放入試管中，2 500 r/min離心10 min，取血清放-20℃冰箱保存。血清NO測定采用硝酸還原酶法，血清中的SOD、MDA測定分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 電鏡制作 缺血再灌注組、穩(wěn)心顆粒大小劑量組每組各取1只，迅速去心臟，在結(jié)扎線下?lián)p傷的心肌組織處取5 mm×5 mm×2 mm組織各1塊，置于4%戊二醛溶液中固定，送電鏡室經(jīng)脫水、包埋、切片、載網(wǎng)、染色后進行電鏡(JEM-1200EX/S型透射電鏡，日本光學(xué)電子公司生產(chǎn))觀察，攝片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS11.5軟件進行處理，數(shù)據(jù)以s表示，各組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中SOD、MDA的改變 血清SOD:與缺血再灌注組比較，假手術(shù)組與兩給藥組顯著升高(P＜0.05);與假手術(shù)組比較，兩給藥組差異無顯著性;兩給藥組之間差異無顯著性。血清MDA:與缺血再灌注組比較，假手術(shù)組與兩給藥組顯著降低(P＜0.05);與假手術(shù)組比較，兩給藥組差異無顯著性;兩給藥組之間差異無顯著性。見表1。

表1 各組血清SOD、MDA的改變(n=10)

2.2 血清中 NO的改變 與缺血再灌注組〔(14.66 ±2.58)μmol/L〕比較，假手術(shù)組〔(18.84 ±2.56)μmol/L〕與兩個給藥組血清 NO〔大劑量組(14.24 ±3.74)μmol/L，小劑量組(9.86 ±3.10)μmol/L〕顯著升高(P ＜0.05);與假手術(shù)組比較，大劑量組升高(P＜0.05);兩給藥組之間差異顯著(P＜0.05)。

2.3 電鏡結(jié)果 缺血再灌注組可見部分血管內(nèi)皮細胞核不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝聚，基膜溶解，內(nèi)皮細胞上出現(xiàn)突起，細胞質(zhì)致密，局部呈水腫狀，周細胞體水腫，呈空化。內(nèi)皮細胞內(nèi)線粒體輕度腫脹。兩給藥組可見血管內(nèi)皮細胞基膜較清楚，內(nèi)皮細胞表面仍有突起，其內(nèi)未見染色質(zhì)趨邊凝聚，核內(nèi)基質(zhì)輕度空化，內(nèi)皮細胞內(nèi)線粒體未見腫脹及空化。

3 討論

臨床實驗報道〔1〕，以診斷標(biāo)準(zhǔn)符合WHO推薦的冠心病及診斷標(biāo)準(zhǔn)的冠心病心絞痛患者為研究對象，通過測量肱動脈內(nèi)徑，間接檢測血管內(nèi)皮功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒能夠改善冠心病患者動脈內(nèi)皮功能，具體機制尚不清楚，可能與其改善微循環(huán)、擴張血管、降低管壁張力、利于受損的血管內(nèi)皮修復(fù)有關(guān)。

NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的一種內(nèi)皮細胞依賴性舒張因子，生理狀態(tài)下與ET各自維持其生理釋放量，保持動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)血管的舒縮。本實驗結(jié)果提示內(nèi)皮細胞的完整性與血清中NO的含量密切相關(guān)，內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)越完整，NO含量越高，因此，NO是反映冠脈內(nèi)皮細胞功能的重要指標(biāo)。雖然兩給藥組電鏡下結(jié)構(gòu)完整性未見明顯差異，但NO分泌量隨應(yīng)用穩(wěn)心顆粒劑量的增加而增加。該結(jié)論與Wei等〔2〕的實驗結(jié)果一致，應(yīng)用藥物削弱缺血再灌注中NO釋放的減少，可以起到保護心肌細胞和內(nèi)皮細胞的作用。

缺血再灌注時氧自由基的爆發(fā)性產(chǎn)生，結(jié)果導(dǎo)致心肌SOD活性明顯下降，大量產(chǎn)生的氧自由基不能被及時清除，與細胞膜性結(jié)構(gòu)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成大量MDA。而兩給藥組血中SOD的相對增多說明缺血再灌注損傷可抑制氧化酶的活性，而穩(wěn)心顆粒通過其抗氧化作用有效地保護對內(nèi)皮細胞及心肌細胞。

1 張華茹，張勇剛.步長穩(wěn)心顆粒治療冠心病心絞痛及對動脈內(nèi)皮功能的影響〔J〕.步長穩(wěn)心顆粒臨床應(yīng)用征文論文集，2003;12:377-8.

2 Wei LC，Ching HC，Yang CW，et al.The vascular and cardioprotective effects of liriodenine in ischemia-reperfusion injury via NO-dependent pathway〔J〕.Nitric Ocide，2004;11:307-15.