CAR siRNA對睪丸支持細胞上皮屏障通透性的影響及機制

李興旺，趙艷玲

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江溫州325027)

睪丸支持細胞位于曲細精管內(nèi)基底膜附近，不僅為生精細胞的持續(xù)發(fā)育和分化提供結(jié)構(gòu)上的支持和營養(yǎng)的供給，而且形成了一種非常重要的生理結(jié)構(gòu)——血睪屏障，從而確保精子發(fā)生的順利進行［1，2］。血睪屏障的構(gòu)成和功能受到精密調(diào)控。如Occludin蛋白是一種緊密連接膜蛋白［3］，其磷酸化參與調(diào)節(jié)了精母細胞穿過血睪屏障過程中屏障功能的變化［4，5］。柯薩奇病毒—腺病毒受體(CAR)屬于免疫球蛋白超家族，是廣泛存在于上皮和內(nèi)皮組織的一種緊密連接跨膜蛋白［6～8］。在大鼠生精上皮，CAR表達于支持細胞和處于遷移過程中的生精細胞［6，9］，但其生理作用目前尚不明了。本研究采用體外血睪屏障模型(支持細胞上皮屏障模型)，觀察CAR小干擾RNA(si RNA)對支持細胞上皮屏障通透性的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、表皮生長因子(EGF)、大豆胰蛋白酶抑制劑、Ⅱ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶S-Ⅰ型、DNA酶Ⅰ購自美國Sigma公司;24孔細胞培養(yǎng)板由美國Corning公司提供;MillicellOR-PCF型插入小室(膜面積為0.6 cm2)和MillicellOR-ERS(electrical resistance system)購自美國Millipore公司。單克隆兔抗Occludin抗體和FITC-山羊抗兔IgG分別購自美國Zymed Laboratories公司和英國Abcam公司。BX53熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;Macprobe 5.1處理軟件。凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio Rad公司;siRNA購自美國Ambion公司。

1.2 體外血睪屏障模型制備及分組 采用睪丸支持細胞原代雙室培養(yǎng)方法［10，11］制備睪丸支持細胞上皮屏障，即體外血睪屏障模型。大鼠睪丸原代支持細胞經(jīng)分離、接種、培養(yǎng)、純化、鑒定而獲得。將制備好的支持細胞混懸液按照每毫升2.5×106(按膜面積計算為1.67×106/cm2)細胞密度接種于雙室模型的插入小室內(nèi)。培養(yǎng)條件為5%CO2、35℃恒溫恒濕培養(yǎng)。將細胞分為CAR siRNA組、對照組。CAR siRNA組細胞培養(yǎng)3 d后，采用100 nmol/L的CAR siRNA(5'-CCUGAACAGAGGAUCGAAATT-3')和RiboJuice siRNA轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染24 h;對照組采用100 nmol/L無同源性非靶向雙鏈RNA及RiboJuice siRNA轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。兩組均按照說明書嚴格操作。

1.3 支持細胞中CAR mRNA檢測 采用RT-PCR法。轉(zhuǎn)染后第2天，收集細胞，按照TRIzol試劑盒說明書抽提細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增。CAR基因的上游引物5'-CGCTCCTACTGTGCTTC-3'，下游引物 5'-CTTTCTGGTTATCGGACGG-3'。內(nèi)參基因 S-16的上游引物5'-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCTT-3'，5'-GCCAAACTTCTTGGTTTCGCAGCG-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，之后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1.4 睪丸支持細胞中CAR、Occludin蛋白檢測 采用蛋白印跡法。轉(zhuǎn)染結(jié)束后第2天，收集細胞，提取兩組細胞總蛋白。蛋白經(jīng)定量后，進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后通過電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉1 h后，加入相應(yīng)的一抗(CAR、Occludin)及二抗，孵育反應(yīng)、洗膜、ECL曝光、顯影、洗片、拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，目的蛋白相對含量以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示。

1.5 跨上皮電阻(TER)測定 大鼠睪丸支持細胞原代雙室培養(yǎng)模型建立后，采用Millicell-ERS電阻系統(tǒng)測量雙室模型內(nèi)外室的電位差。具體方法參照Janecki等［11］的研究報道。TER值的計算公式:TER=(測定值-空白本底值)/膜的有效生長面積。

1.6 睪丸支持細胞的Occludin蛋白檢測及分布觀察 參照文獻［12］方法，采用免疫熒光細胞化學(xué)染色法檢測Occludin蛋白。從插入小室中吸出培養(yǎng)液，PBS(含 1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2)潤洗2次，去除殘留的培養(yǎng)液;加入足量含2.5%多聚甲醛的PBS，室溫下孵育15 min，吸去多聚甲醛;加入含50 mmol/L NH4Cl的PBS，充分洗去剩余甲醛;加入含0.5%Triton的PBS，進行細胞膜打孔，室溫下放置10 min;PBS潤洗后，加入1%BSA室溫下封閉30 min;加入50 μL 1～2 μg/mL單克隆兔抗 Occludin抗體，37℃放置30 min，PBS潤洗;加入FITC-山羊抗兔IgG抗體，37℃放置30 min，PBS潤洗3～4次，晾干后，在熒光顯微鏡觀察Occludin分布情況。

1.7 睪丸支持細胞中與早期內(nèi)涵體抗原1(EEA1)抗體結(jié)合的Occludin蛋白檢測 將2 μg正常兔IgG加入含有300 μg蛋白的支持細胞裂解液，孵育1 h;然后加入10 μL蛋白A/G瓊脂糖珠，孵育1 h，4℃離心后取上清液。在上清液中加入2 μg正常兔IgG(陰性對照)或EEA1抗體，室溫過夜。然后加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖珠，孵育1 h。糖珠—抗原抗體復(fù)合物經(jīng)裂解液洗滌，在SDS-PAGE加樣緩沖液中100℃煮沸5 min，離心吸取上清液。Western blotting法檢測免疫沉淀后特異性結(jié)合的Occludin蛋白量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗或秩和檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

CAR siRNA組與對照組CAR mRNA相對表達量分別為 0.122 ±0.013、0.429 ±0.039，CAR 蛋白相對表達量分別為 0.142 ±0.041、0.532 ±0.022，兩組比較，P均＜0.05。睪丸支持細胞的TER在轉(zhuǎn)染前3 d逐漸升高;3 d后穩(wěn)定。轉(zhuǎn)染結(jié)束后第2天CAR siRNA組與對照組TER分別為(37±2.5)、(50±3.0)ohm·cm2，轉(zhuǎn)染后第 3 天分別為(38 ±2.4)、(47 ±2.9)ohm·cm2，兩組比較，P ＜0.05。見圖1。

圖1 睪丸支持細胞培養(yǎng)不同時間點TER的變化

CAR siRNA組與對照組Occludin蛋白相對表達量分別為 0.164 ±0.025、0.143 ±0.031，兩組比較，P＞0.05。對照組細胞Occludin呈蜂巢樣沿細胞膜線狀分布;而CAR siRNA組分布較紊亂，細胞膜處減少，線性分布破壞，在細胞質(zhì)內(nèi)增多(圖2)。與EEA1結(jié)合的Occludin蛋白量CAR siRNA組、對照組分別為 1.332 ±0.018、1.000 ±0.015，兩組比較，P ＜0.05。

圖2 兩組睪丸支持細胞Occludin表達

3 討論

血睪屏障是機體最有效的保護屏障之一，可阻止某些大分子物質(zhì)經(jīng)血液或淋巴途徑進入曲細精管管腔，能調(diào)節(jié)生物活性物質(zhì)在生精上皮內(nèi)的濃度，同時具有免疫屏障作用，創(chuàng)造穩(wěn)定生精內(nèi)環(huán)境［2］。本實驗培養(yǎng)的原代支持細胞之間逐漸形成屏障，電子顯微鏡下觀察到血睪屏障的緊密連接、基底細胞外質(zhì)特化、間隙連接和橋粒等超微結(jié)構(gòu)，因此支持細胞上皮屏障模型是體外常用的模擬血睪屏障模型［10，11］。

TER由離子經(jīng)細胞旁間隙流動形成，是檢測細胞旁通透性的常用指標，可以反映支持細胞上皮屏障的通透性(完整性)［13］。對照組細胞在培養(yǎng)過程中，TER值逐漸升高，波峰形成于培養(yǎng)后3～4 d(屏障形成)，然后在4～7 d維持穩(wěn)定的TER值，同Lie等［9］的研究結(jié)果一致。

CAR作為柯薩奇病毒和腺病毒的特異受體，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，因其在病毒感染宿主細胞過程中的重要介導(dǎo)作用而被廣泛研究。在病毒攻擊宿主細胞過程中，病毒纖維蛋白突競爭性地抑制宿主細胞之間原有的CAR-CAR連接，代之以病毒-CAR連接，從而破壞原有的連接復(fù)合體，病毒得以穿越上皮?，F(xiàn)有研究提示CAR在不同組織的分布不同，且作用多樣，需進一步闡明。在生精上皮周期第八階段，生精細胞穿過血睪屏障的行為非常類似柯薩奇病毒和腺病毒侵染宿主細胞的行為，因此生精細胞很可能采用同種“策略”穿越血睪屏障，即支持細胞—生精細胞之間的CAR-CAR連接，競爭性地取代了血睪屏障處原有的支持細胞間的CAR-CAR連接，從而使生精細胞通過血睪屏障進入生精上皮頂部微環(huán)境進一步發(fā)育成熟［14］。本研究結(jié)果顯示，CAR siRNA組CAR mRNA、蛋白含量較對照組顯著降低，表明siRNA有效干擾了目的基因表達。CAR沉默使TER降低，提示通透性增強，屏障功能降低，表明CAR表達變化的確可以改變支持細胞上皮的完整性，影響血睪屏障的功能，支持了上述推測。

本研究同時觀察了CAR基因?qū)χС旨毎蠴ccludin蛋白表達和分布的影響。在血睪屏障，Occludin是構(gòu)成緊密連接的重要組分之一，其功能的發(fā)揮與表達量及分布密切相關(guān)［4，5］。Western blotting分析顯示，CAR干擾后Occludin表達量沒有變化，但其分布發(fā)生改變。免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常時Occludin分布于細胞膜、細胞間連接處，呈線性;而CAR siRNA組Occludin分布較紊亂，細胞膜處減少，線性分布破壞，由細胞間連接處向細胞質(zhì)內(nèi)移增多。另外，已知EEA1是一內(nèi)吞膜泡相關(guān)蛋白，是內(nèi)涵體的標志物［15］。CAR siRNA組中與 EEA1結(jié)合的Occludin量升高，表明Occludin向細胞質(zhì)內(nèi)移增多是通過內(nèi)吞增加引起的。以上結(jié)果提示，CAR沉默后引起支持細胞屏障通透性改變，至少部分是誘導(dǎo)Occludin蛋白內(nèi)吞增強而分布改變的結(jié)果，表明CAR不只是血睪屏障的結(jié)構(gòu)分子，而且對其他分子表達和功能等方面有調(diào)控作用。有研究表明，Occludin內(nèi)吞與其磷酸化變化有關(guān)，可能CAR降低表達后導(dǎo)致磷酸酶活性改變，然后使Occludin磷酸化改變，最終導(dǎo)致Occludin分布改變;而參與的磷酸酶可能是非受體酪氨酸激酶c-Src，因為在血睪屏障該酶與CAR可形成蛋白復(fù)合物［4］，這需進一步研究。

研究證實，血睪屏障對于生精上皮處精子發(fā)育至關(guān)重要。例如，血睪屏障在生精上皮周期的第Ⅷ至第Ⅸ階段要經(jīng)歷大量的“打開—閉合”拆解和重建等完整性變化，以使前細線期生精細胞通過屏障進入頂部進一步發(fā)育。因此，如果能發(fā)現(xiàn)參與這一特定過程的靶分子，通過對靶分子的調(diào)控從而控制血睪屏障“開而不閉”或“閉而不開”，那么最終可干擾精子發(fā)生。本實驗結(jié)果提示，CAR是與睪丸支持細胞上皮屏障調(diào)控密切相關(guān)的分子，因此，它是開發(fā)避孕藥及探索不孕不育癥機制的潛在靶點。

綜上所述，CAR siRNA能增加睪丸支持細胞上皮屏障通透性，其機制可能與CAR誘導(dǎo)Occludin蛋白內(nèi)吞增強而分布改變有關(guān)。

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