氫氣飽和等滲鹽水腹腔注射治療兔創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

馬廣斌，黃永吉，嚴(yán)冬雪

0 引 言

隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活節(jié)奏的加快，創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎(traumatic arthritis，TA)的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)。TA又稱外傷性關(guān)節(jié)炎或損傷性骨關(guān)節(jié)病。以關(guān)節(jié)疼痛活動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn)。目前臨床上對(duì)于早期TA的診斷缺乏明確的指標(biāo)，后期的治療又缺乏特異性藥物，大量患者在疾病發(fā)展的后期嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，重者甚至導(dǎo)致殘疾。對(duì)于TA的診斷和治療已普遍引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。近年來(lái)的研究對(duì)其發(fā)病機(jī)制有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為TA病理演化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)即為炎癥。

Charib等［1］首次證明氫氣具有抗炎作用。Ohsawa等［2］報(bào)道動(dòng)物呼吸2%的氫氣就可以有效清除自由基，改善腦缺血再灌注損傷。近年來(lái)，大量的研究表明，作為一種選擇性抗氧化物質(zhì)，氫氣具有抗氧化、抗炎癥等作用，并對(duì)多種疾病治療效果顯著［3-5］。本研究旨在探討氫氣對(duì)TA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 8～12月齡普通級(jí)雌性新西蘭家兔26只，體重2.0～2.5 kg，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào):SCXK桂2003-0003)，普通級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，室內(nèi)保持12 h光照、12 h避光的循環(huán)飼養(yǎng)，控制室溫為(22±1)℃、相對(duì)濕度50%～60%。所有動(dòng)物按標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料分籠喂養(yǎng)，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將26只家兔分為模型實(shí)驗(yàn)組10只、模型對(duì)照組10只和正常對(duì)照組6只。

1.2 TA模型的建立 模型組20只家兔10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。按Han等［6］提供的方法選擇家兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)，嚴(yán)格術(shù)區(qū)消毒及術(shù)中無(wú)菌操作行右膝半月板切除術(shù)，術(shù)后縫合皮膚無(wú)菌紗布包扎傷口;正常對(duì)照組行假手術(shù)，手術(shù)當(dāng)天給予青霉素肌內(nèi)注射抗炎治療，以防止術(shù)口感染，連用1周。

1.3 模型建立成功的判斷標(biāo)準(zhǔn) 手術(shù)后13周時(shí)對(duì)TA模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。①行為改變標(biāo)準(zhǔn):出現(xiàn)疼痛行為，觸摸右膝關(guān)節(jié)時(shí)出現(xiàn)彈腿掙扎。平地驅(qū)趕行走時(shí)右后肢跛行;②影像學(xué)評(píng)價(jià):將造模家兔右后肢行X線檢查，X線下見(jiàn)不同程度的骨贅形成，軟骨下骨硬化，骨質(zhì)疏松，但關(guān)節(jié)間隙還未出現(xiàn)明顯狹窄(符合此改變者說(shuō)明造模成功);③膝關(guān)節(jié)腫脹積分法［7］:0=無(wú);1=可觸及腫脹;2=可視下腫脹。

1.4 治療藥物及給藥途徑

1.4.1 藥物 氫氣由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，氫氣飽和等滲鹽水的制備按照文獻(xiàn)［8］的方法進(jìn)行。

1.4.2 給藥方法 動(dòng)物模型第13周開(kāi)始給藥，模型實(shí)驗(yàn)組予以8 mL/kg氫氣飽和等滲鹽水腹腔注射，模型對(duì)照組予以等量等滲鹽水腹腔注射，每3天注射1次，持續(xù)6周，正常對(duì)照組不做任何處理，其余條件相同。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) ①行為改變標(biāo)準(zhǔn):0=明顯改善(即觸摸右膝關(guān)節(jié)時(shí)彈腿掙扎不明顯。平地驅(qū)趕行走時(shí)右后肢跛行較輕)，1=改善不明顯(即觸摸右膝關(guān)節(jié)時(shí)彈腿掙扎明顯。平地驅(qū)趕行走時(shí)右后肢跛行明顯)。②膝關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分。③血清與關(guān)節(jié)液中HA的含量:在腹腔注射前及治療結(jié)束后各組均采取耳緣靜脈血3 mL，立即分離血清，檢測(cè)HA，同上述2個(gè)時(shí)間段用注射用水2 mL沖洗關(guān)節(jié)腔，取沖洗液離心，取上清液測(cè)定關(guān)節(jié)液中HA含量。④同上述中的時(shí)間及方法各取家兔靜脈血及關(guān)節(jié)液測(cè)定NO含量，NO測(cè)定用硝酸還原酶法，試劑盒由南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法進(jìn)行檢驗(yàn)比較;多樣本率或構(gòu)成比的比較用卡方檢驗(yàn)，同一受試對(duì)象在接受處理前后的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 26只家兔均健康存活，無(wú)一例死亡;體重增加8%～46%，平均21%，無(wú)一例體重下降;正常對(duì)照組無(wú)一例出現(xiàn)疼痛行為的改變。

2.2 氫氣飽和等滲鹽水對(duì)TA的影響

2.2.1 各組動(dòng)物行為學(xué)改變情況 氫氣飽和等滲鹽水組10只家兔治療后有8只改善明顯，剩余2只無(wú)明顯變化。模型實(shí)驗(yàn)組有3只行為活動(dòng)有改善，剩余7只變化不明顯。提示氫氣飽和等滲鹽水對(duì)改善TA癥狀有明顯效果。

2.2.2 各組動(dòng)物關(guān)節(jié)腫脹變化的比較 造模成功后，第13及19周分別對(duì)模型組的20只動(dòng)物進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)外觀檢查。13周時(shí)模型組20只家兔右膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的腫脹，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);19周治療結(jié)束時(shí)，模型實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型對(duì)照組治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，關(guān)節(jié)腫脹無(wú)明顯減輕，正常組前后無(wú)特殊變化。見(jiàn)表1。

表1 治療前后各組家兔右膝關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分變化比較(n)Table 1 Comparison of knee swelling scores between the two groups pre-and post-treatment(n)

2.2.3 各組動(dòng)物治療前后關(guān)節(jié)液及血清中NO含量 治療前模型組動(dòng)物血清中NO含量有升高的趨勢(shì)(P＜0.05)，關(guān)節(jié)液中 NO含量明顯升高(P＜0.01)。治療后模型實(shí)驗(yàn)組血清及關(guān)節(jié)液中NO的含量均下降(P＜0.05)，尤以關(guān)節(jié)液中下降更明顯(P＜0.01)。模型對(duì)照組無(wú)明顯變化(P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 治療前后各組家兔血清及關(guān)節(jié)液中NO的含量變化(±s)Table 2 Changes of NO content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

表2 治療前后各組家兔血清及關(guān)節(jié)液中NO的含量變化(±s)Table 2 Changes of NO content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;與治療前比較，#P ＜0.05、##P ＜0.01

組別 n 治療前 治療后血清 關(guān)節(jié)液正常對(duì)照組 6 75.18±14.80 70.26±10.53血清 關(guān)節(jié)液——模型實(shí)驗(yàn)組 10 79.58±13.46* 89.45±14.98＊＊76.23±12.15#80.36±12.78##模型對(duì)照組 10 78.22±13.96 89.78±14.11 77.13±12.85 87.21±15.36

2.2.4 各組動(dòng)物治療前后血清及關(guān)節(jié)液中HA的含量 治療前模型組血清中HA的含量明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，關(guān)節(jié)液中HA含量明顯低于正常組(P＜0.05)。治療后模型實(shí)驗(yàn)組血清中HA含量明顯下降(P＜0.05)，關(guān)節(jié)液中HA的含量上升(P＜0.05)，模型對(duì)照組治療前后變化不明顯(P ＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組家兔治療前后血清及關(guān)節(jié)液中HA含量變化(±s)Table 3 Changes of HA content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

表3 各組家兔治療前后血清及關(guān)節(jié)液中HA含量變化(±s)Table 3 Changes of HA content in serum and joint fluid pre-and post-treatment(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與治療前比較，#P ＜0.05

組別 n 治療前 治療后血清 關(guān)節(jié)液正常對(duì)照組 6 338.26±41.27 2.41±0.41血清 關(guān)節(jié)液——模型實(shí)驗(yàn)組 10 436.82±60.91* 1.72±0.37* 340.21±40.57# 2.47±0.62#模型對(duì)照組 10 430.96±58.72 1.84±0.42 432.12±47.27 1.72±0.37

從以上各項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)可分析得出，模型實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)氫氣飽和等滲鹽水腹腔注射后在行為學(xué)、組織因子及自由基變化上表現(xiàn)為治療前后有明顯差異。可以認(rèn)為氫氣飽和等滲鹽水腹腔注射可能對(duì)TA的治療可能有一定效果。

3 討 論

3.1 氫氣在疾病治療方面的新認(rèn)識(shí) Buchholz等［9］首次證明了呼吸氫氣能保護(hù)小腸移植后的損傷，首次檢測(cè)了炎癥因子在實(shí)驗(yàn)中的變化，并依此提出了氫氣具有抗炎癥的作用。國(guó)外也有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)氫氣在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面取得了一定療效，治療手段為讓患者每天飲用高濃度氫氣水530 mL［10］。用血液和尿液中8羥基鳥(niǎo)嘌呤作為氧化損傷的指標(biāo)，用C反應(yīng)蛋白作為炎癥反應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿液氧化指標(biāo)和炎癥反應(yīng)指標(biāo)均顯著下降，5名早期患者全部都明顯緩解，其中4名患者在整個(gè)治療結(jié)束后癥狀完全消失。該研究說(shuō)明，作為一種抗氧化物質(zhì)，氫氣具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。Chen等［11］的研究表明氫氣在治療脊髓損傷方面有一定的效果，這是所見(jiàn)報(bào)道中首次涉及氫氣治療創(chuàng)傷性疾病的研究，同時(shí)也為本實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展引領(lǐng)了方向，是本組實(shí)驗(yàn)研究的目的之所在。

3.2 氫氣治療TA機(jī)制的探討 TA主要是負(fù)重關(guān)節(jié)損傷后引起的一種后遺癥，是由于連續(xù)的物理性或機(jī)械性損傷導(dǎo)致的可運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)的軟骨變性破壞，以及在此基礎(chǔ)上的關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下軟骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊及周圍的肌肉組織和韌帶的一系列改變而引起的關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙［12］。國(guó)內(nèi)許鵬等［13］研究證實(shí)TA發(fā)病機(jī)制過(guò)程中有自身免疫反應(yīng)發(fā)生，并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)這一結(jié)論。在測(cè)定TA血清和關(guān)節(jié)液中自由基的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)此類患者關(guān)節(jié)液中存在較高水平自由基，結(jié)合已被學(xué)者所共識(shí)的NO在各種自身免疫性關(guān)節(jié)炎中的重要作用，故認(rèn)為NO和自由基在TA的發(fā)病中具有重要的作用。這也是本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)TA動(dòng)物模型治療效果的主要指標(biāo)。

TA發(fā)生發(fā)展的主要因素是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與軟骨基質(zhì)之間的失衡。軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)合成基質(zhì)，基質(zhì)為細(xì)胞提供力學(xué)支持，兩者之間的穩(wěn)定決定了關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)定性［14］。而兩者關(guān)系遭受破壞的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。透明質(zhì)酸是軟骨基質(zhì)糖胺多糖的主要組成成分，在滑膜關(guān)節(jié)中。HA在軟骨和關(guān)節(jié)液中起主要潤(rùn)滑作用，關(guān)節(jié)損傷以后HA在血清和關(guān)節(jié)液中的含量及分子量均會(huì)有相應(yīng)的變化，這成為本實(shí)驗(yàn)的又一檢測(cè)指標(biāo)［15-16］。

多項(xiàng)研究表明，氫氣具有選擇性抗氧化作用，能自由穿過(guò)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，分布于細(xì)胞液、線粒體內(nèi)，可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化損傷的最重要的介質(zhì)［17-18］。從這一角度不難看出，以氧化應(yīng)激為發(fā)病機(jī)制的多種疾病、炎癥、慢性疼痛以及缺血均成為了氫氣治療的研究方向。本組實(shí)驗(yàn)同樣取得了比較理想的效果。對(duì)于NO等含量的變化符合炎癥轉(zhuǎn)歸的變化，我們初步認(rèn)為氫氣在治療TA中的治療機(jī)制同樣是選擇性抗氧化作用。

3.3 氫氣治療TA的前景展望 由于缺乏特異性的指標(biāo)與早期臨床表現(xiàn)，TA的早期或中期診斷往往較為困難。對(duì)于TA的治療目前仍缺乏特異性藥物。一般療法及溫?zé)岑煼ā⑨樉?、推拿、微波紅外等物理療法只能延緩或阻止早期病程的進(jìn)一步發(fā)展，但效果的可靠性因人而異。對(duì)于藥物療法，目前臨床應(yīng)用較多的包括非甾體抗炎藥、昔布類藥物、軟骨保護(hù)藥物及中草藥。最為傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥也有著腎損傷、軟骨損害、消化道損傷等副作用。外科手術(shù)因?qū)υ缙鸹颊哌m應(yīng)證較窄、創(chuàng)傷較大而受到限制，只能為部分生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，有致殘可能的晚期患者所接受?；蛑委熓且环N新興的治療手段，其療效和臨床應(yīng)用還有待于進(jìn)一步發(fā)展［15］。目前的研究認(rèn)為選擇性抗氧化作用使得氫氣在體內(nèi)的“選擇”較少，參與的機(jī)體反應(yīng)相對(duì)較少，未見(jiàn)對(duì)機(jī)體有副作用，而且價(jià)格低廉，能為廣大患者所接受。目前研究的氫氣水、氫氣飽和等滲鹽水可通過(guò)直接飲用、局部注射、靜脈注射等途徑給藥，如果大量的研究證實(shí)氫氣治療TA的療效，將為廣大患者帶來(lái)新的希望。

關(guān)于氫氣在治療TA中的作用機(jī)制，還只是處于初步探討的階段，仍有待于進(jìn)一步研究。作為一個(gè)新興的領(lǐng)域，由于研究的深度和廣度有限，目前尚難以進(jìn)行全面清晰的描述。目前大量實(shí)驗(yàn)僅局限于在動(dòng)物模型上進(jìn)行，其對(duì)人體疾病的作用及是否具有目前尚未檢測(cè)出的毒副作用，需更為長(zhǎng)期研究加以證實(shí)。氫氣是否就是一種理想的選擇性抗氧化物質(zhì)，其選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子的機(jī)制目前也存在爭(zhēng)議［19］，但在動(dòng)物模型身上證明了其治療疾病的有效性，這為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Gharib B，Hanna S，Abdallahi OM，et al.Anti-inflammatory properties of molecular Hydrogen:investigation on parasite-induced liver inflammation［J］.C R Acad Sci III，2001，324(8):719-724.

［2］ Ohsawa I，Ishikawa M，Takahashi K，et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic Oxygen radicals［J］.Nat Med，2007，13(6):688-694.

［3］ Sun XJ，Zhang JH.Hydrogen-an endogenous antioxidant in the body［J］.Acad J Sec Mil Med Univ，2008，29(3):233-235.

［4］ Hayashida K，Sano M，Ohsawa I，et al.Inhalation of Hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemiareperfusion injury［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，373(1):30-35.

［5］ Sato Y，Kajiyama S，Amano A，et al.Hydrogen-rich pure water prevents superoxide formation in brain slices of vitamin C-depleted SMP30/GNL knockout mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，375(3):346-350.

［6］ Han F，Ishiguro N，Ito T，et al.Effects of Sodium hyaluronate on experimental osteoarthritis in rabbit knee joints［J］.Nagoya J Med Sci，1999，62(3-4):115-126.

［7］ Tominaga K，Alstergren P，Kurita H，et al.Clinical course of an antigen-induced arthritis model in the rabbit temporomandibular joint［J］.J Oral Pathol Med，1999，28(6):268-273.

［8］ 鄭 娟，劉 刊，蔡建美，等.氫氣飽和生理鹽水對(duì)肺型氧中毒保護(hù)效應(yīng)的研究［J］.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2009，16(4):197-199.

［9］ Buchholz BM，Kaczorowski DJ，Sugimoto R，et al.Hydrogen inhalation ameliorates oxidative stress in transplantation induced intestinal graft injury［J］.Am J Transplant，2008，8(10):2015-2024.

［10］ Ishibashi T，Sato B，Rikitake M，et al.Consumption of water containing a high concentration of molecular Hydrogen reduces oxidative stress and disease activity in patients with rheumatoid arthritis:an open-label pilot study［J］.Medical Gas Research，2012，2(1):27-34.

［11］ Chen C，Chen Q，Mao Y，et al.Hydrogen-rich saline protects against spinal cord injury in rats［J］.Neurochem Res，2010，35(7):1111-1118.

［12］ 賞后來(lái)，郭 亭，趙建寧.骨性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的意義及研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2012，25(2):204-207.

［13］ 許 鵬，靳衛(wèi)章，姚建鋒，等.創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中自由基水平及意義［J］.實(shí)用骨科雜志，2001，7(3):186-188.

［14］ Weng LH，Wang CJ，Jy K，et al.Inflammation induction of dickkopf-1 mediates chondrocyte apoptosis in osteoarthritis joint［J］.Osteoarthritis and Cartilage，2009，17(7):933-943.

［15］ 谷貴山，孫大輝，車明學(xué).創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2002，6(1):20-21.

［16］ Gr?bner S，Adkins I，Schulz S，et al.Catalytically active Yersinia outer protein P induces cleavage of RIP and caspase-8 at the level of the DISC independently of death receptors in dendritic cells［J］.Apoptosis，2007，12(10):1813-1825.

［17］ Kajiyama S，Hasegawa G，Asano M，et al.Supplementation of hydrogen-rich water improves lipid and glucose metabolism in patients with type 2 diabetes or impaired glucose tolerance［J］.Nutr Res，2008，28(3):137-143.

［18］ 惠康麗，韓云飛，周玉弟，等.富氫液對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24(6):573-577.

［19］ Wood KC，Gladwin MT.The Hydrogen highway to reperfusion therapy［ J］.Nat Med，2007，13(6):673-674.