活化Caspase 9在?；撬岜Ｗo神經細胞中的保護作用

劉 陽，王李瑤，張慶華，夏鶴春 ，孫 濤

0 引 言

腦出血、腦外傷、神經退行性疾病、腦腫瘤等疾病都與神經細胞的凋亡有著密切聯(lián)系。研究表明Caspase在神經系統(tǒng)疾病細胞凋亡進程中起到的很重要的作用［1-2］。Caspase通過外源性途徑或內源性細胞凋亡途徑激活介導了細胞的凋亡，通過釋放線粒體細胞色素C到細胞質，活化Caspase 9和隨后其他Caspases，其中Caspase 9處于凋亡有序級聯(lián)反應的上游可激活下游Caspase3，進而誘導蛋白水解酶作用于關鍵調解蛋白和結構蛋白最終使細胞凋亡［3-4］。

?；撬?taurine)是人體內含量較高的游離氨基酸，是一種條件必需氨基酸，在細胞中發(fā)揮著多種作用，如滲透壓調節(jié)、細胞質鈣水平的調節(jié)、生長發(fā)育營養(yǎng)因子等。研究表明牛磺酸對神經系統(tǒng)有較強的保護作用［5］。本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠海馬神經元細胞，采用谷氨酸誘導細胞凋亡，觀察不同濃度牛磺酸對海馬神經元凋亡的抑制作用，研究?；撬釋ι窠浵到y(tǒng)的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠永生性海馬神經元細胞株HT_22購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。Caspase 9抗體購自cell signal technology公司，谷氨酸、?；撬豳徸許igma公司，BetaActin、DAPI購自博奧森公司，二抗、FITC標記二抗購自北京中杉金橋公司，MTT試劑盒購自trevigen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將小鼠永生性海馬神經元細胞株HT_22置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，取生長良好的第5～8代處于對數(shù)生長期且細胞活性＞80%的細胞進行實驗。

將細胞密度調整為1×105個/mL，按以下條件進行分組:正常HT_22細胞為對照組;HT_22細胞加入終濃度為4 mmol/L谷氨酸為損傷凋亡組;HT_22細胞加入終濃度為4 mmol/L谷氨酸和0.5 mmol/L?；撬釣榈蛣┝勘Ｗo組;HT_22細胞加入終濃度為4 mmol/L谷氨酸和2 mmol/L?；撬釣楦邉┝勘Ｗo組。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后終止。

1.2.2 細胞生長狀態(tài)觀察 各組干預培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下選擇5個視野，觀察細胞數(shù)量，細胞形態(tài)，以及神經元間網絡的形成。

1.2.3 MTT檢測各組細胞生長活力 將細胞密度調整為1×105個/mL，每孔100 uL接種于96孔板。生長24h后，按各個分組加入相應干預后將96孔板培養(yǎng)24 h，漂洗細胞2次后加入90 μL新鮮培養(yǎng)液。再加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清。每孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。490 nm處檢測各孔吸光度(A)值。實驗結果取每組6個復孔平均值。計算公式:

A值=(1-實驗組A值)/對照組A值×100%

1.2.4 細胞免疫化學熒光檢測Caspase 9表達細胞生長24 h后，將處于對數(shù)生長期的細胞，無血清培養(yǎng)6 h。吸出培養(yǎng)基，按以上設計方法進行分組干預。按分組接種在12孔板中的無菌蓋玻片上。加入谷氨酸及?；撬岣深A后24 h，4%多聚甲醛固定液固定 30 min，TritonX-100，37℃滲透 30 min，10%山羊血清封閉30 min，添加一抗4℃孵育12～16 h，滴加1∶200的 FITC 標記的二抗，37℃溫箱孵育1 h，甘油封片10 min。熒光顯微鏡觀察到適宜亮度且圖像清晰的細胞染色，拍照，進一步分析圖像表達結果。

1.2.5 Western blot檢測Caspase 9蛋白的表達 提取不同處理組的細胞總蛋白，計算50 μg蛋白上樣量。電泳(5%濃縮膠，80 V，30 min;10%分離膠120 V，90 min)。濕轉，260 mA，90 min，封閉 1 h 后一抗(1∶500)，4℃孵育過夜。二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h，進入暗室曝光。實驗結果在凝膠成像系統(tǒng)進行掃描和密度分析，以所測目的蛋白與β-actin的比值作為該目的蛋白的定量指標。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較視方差齊性檢驗(以0.1作為檢驗水準進行Levene檢驗)結果進行不同的選擇，當方差齊同時，選擇LSD檢驗，當方差不齊時，選擇Tamhane's T2檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞生長形態(tài)觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察，對照組細胞數(shù)量多，海馬神經元胞體多呈不規(guī)則橢圓形或三角形，有細長的突起且互相連接成網;損傷凋亡組細胞數(shù)量少，神經元樣細胞突起短，網絡稀疏;?；撬岜Ｗo組較損傷組細胞數(shù)量較多，生長狀態(tài)良好，細胞突起長。見圖1。

2.2 MTT監(jiān)測細胞存活力 對照組、損傷凋亡組、低劑量保護組、高劑量保護組MTT相對A值分別為0.643 ±0.013、0.102 ±0.025、0.504 ±0.072和0.452±0.029，損傷凋亡組細胞活力較對照組和低、高劑量保護組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

圖1 倒置顯微鏡下海馬神經元細胞生長形態(tài)(×400)Figure 1 Morphology of the neuronal cells(×400)

2.3 免疫熒光檢測Caspase 9表達 免疫熒光結果顯示損傷凋亡組Caspase 9的陽性表達(A值為61386.8±10 083.6)較對照組(A 值為 4 502.2 ±2518.1)明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。低、高劑量保護組Caspase 9的陽性表達(A值分別為20077.4 ±4187.5和 13976.2 ±7044.1)比損傷凋亡組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 Caspase 9免疫熒光圖(×400)Figure 2 Expression of Caspase 9 in different groups detected by immunofluorescence(×400)

2.4 Western blot檢測Caspase 9在各組中的表達與免疫熒光各組表達同步，在損傷凋亡組Caspase 9的陽性表達(A值為1.23)較對照組(A值為0.17)明顯增高。低、高劑量保護組Caspase 9的陽性表達(A值分別為0.21和0.19)比損傷凋亡組明顯降低。見圖3。

圖3 Caspase 9在各組中的表達Figure 3 Expression of Caspase 9 in different groups detected by Western blot

3 討 論

Caspases被認為是一個調節(jié)細胞死亡的蛋白酶家族，在神經系統(tǒng)發(fā)育中，半胱天冬酶在神經系統(tǒng)中逐漸下調，但繼續(xù)履行重要的非凋亡功能與神經發(fā)生和突觸可塑性相關。在神經退行性疾病，異常神經元死亡是一個突出的特點，同時伴隨是Caspase活性的增加，研究表明Caspase介導的細胞凋亡在神經退行性疾病、腦缺血、腦腫瘤等疾病中發(fā)揮了重要作用［6］。正常狀態(tài)下Caspase家族蛋白酶以無活性的酶原存在，它的活化主要有外源性途徑和內源性途徑。其中Caspase 9介導的是細胞凋亡中的內源途徑也叫線粒體途徑。線粒體直接或間接釋放凋亡因子1(apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1)和細胞色素C。在細胞質內，細胞色素C與Apaf-1聚合Caspase 9，這導致了Caspase 9的活化，活化的Caspase 9激活下游的Caspase 3，后者直接引起細胞凋亡。活化的Caspase 3可以激活核因子、細胞骨架蛋白及DNA修復酶等，促使染色質凝聚和核酶激活，最終導致細胞凋亡［7-9］。Caspase 3是細胞凋亡的最終執(zhí)行者，Caspase 9在凋亡起始中具有重要作用［10］。在本實驗中采用經典損傷模型，既谷氨酸誘導海馬神經元的凋亡，損傷組較對照組明顯生長不良，凋亡率升高同時免疫熒光和蛋白印跡監(jiān)測Caspase 9的表達明顯升高，可見Caspase 9的活化與海馬神經元的凋亡密切相關。

?；撬崾且环N含硫的非蛋白氨基酸，在體內以游離狀態(tài)存在，不參與體內蛋白的生物合成，具有廣泛的細胞保護作用。研究表明牛磺酸與中樞神經系統(tǒng)正常生理功能的維持有密切關系，其在大腦皮質、海馬和小腦等區(qū)域特異性分布，具有促進神經系統(tǒng)生長發(fā)育、增殖分化、增強記憶、延緩衰老等作用［11］。?；撬釋ι窠浵到y(tǒng)細胞的保護作用尚未完全明確，可能是以下幾個機制的綜合作用:①牛磺酸在中樞神經系統(tǒng)內作為一種抑制性氨基酸可對抗興奮性氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸等，通過包括防止膜去極化，抑制神經細胞的興奮性毒性和線粒體能量衰竭，保護目標包括細胞膜，線粒體，內質網膜［12-13］。②牛磺酸阻止細胞內自由基的過氧化，拮抗細胞內氧化還原損傷。③?；撬嵊姓{節(jié)細胞內游離鈣水平的功能，通過抑制鈣離子內流，減弱細胞的去極化趨勢，保護細胞的結構和功能［14-15］。通過以上作用降低了細胞線粒體的損傷及其各種蛋白酶的穩(wěn)定，抑制了Caspase 9介導的線粒體途徑的凋亡進程。在本實驗中通過在損傷模型中加入不同劑量?；撬岣深A后，可見神經細胞生長狀態(tài)明顯好轉，MTT測得凋亡率明顯下降，免疫熒光和蛋白印跡檢測Caspase 9的表達量明顯下降，可見?；撬峥擅黠@降低Caspase 9的活化從而抑制神經細胞的凋亡進程起到了很好的神經保護作用，為牛磺酸在神經系統(tǒng)疾病中的應用提供了理論支撐。

［1］ 岳原亦，張 揚，張一奇.Caspase家族與細胞凋亡［J］.中國醫(yī)療前沿，2011，6:25-26.

［2］ 徐祖才，王學峰，雷顯澤，等.丙戊酸鈉對大鼠海馬神經元癲癇樣放電后細胞外信號調節(jié)激酶磷酸化水平的影響［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(11):1124-1127.

［3］ Allan LA，Clarke PR.Apoptosis and autophagy:Regulation of Caspase 9 by phosphorylation［J］.FEBS J，2009，276(21):6063-6073.

［4］ 盧娜娜，劉 琪，顧立剛，等.疏風宣肺方和解表清里方干預流感病毒性肺炎小鼠細胞凋亡的研究［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(11):1134-1137.

［5］ Kumari N，Prentice H，Wu JY.Taurine and its neuroprotective role［J］.Adv Exp Med Biol，2013，775:19-27.

［6］ Troy CM，Akpan N，Jean YY.Regulation of caspases in the nervous system implications for functions in health and disease［J］.Prog Mol Biol Transl Sci，2011，99:265-305.

［7］ Robert M，F(xiàn)riedlander MD.Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases［J］.N Engl J Med，2003，348(14):1365-1375.

［8］ Riedl SJ，Salvesen GS.The apoptosome:signal-ling platform of cell death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(5):405-413.

［9］ Taylor RC，Cullen SP，Martin SJ.Apoptosis:controlled demolition at the cellular level［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(3):231-241.

［10］ LeBlanc AC.Natural cellular inhibitors of caspases［J］.Prog Neuropsycho-pharmacol Biol Psychiatry，2003，27(2):215-229.

［11］ Chesney RW，Helms RA，Christensen M.The role of taurine in infant nutrition［J］.Adv Exp Med Biol，1998，442:463-476.

［12］ Wu JY，Wu H，Jin Y，et al.Mechanism of neuroprotective function of taurine［J］.Adv Exp Med Biol，2009，643:169-179.

［13］ Chen WQ，Jin H，Nguyen M.Role of taurine in regulation of intracellular calcium level and neuroprotective function in cultured neurons［J］.J Neurosci Res，2001，66(4):612-619.

［14］ Ye HB，Shi HB，Yin SK.Mechanisms underlying taurine protection against glutamate-induced neurotoxicity［J］.Can J Neurol Sci，2013，40(5):628-634.

［15］ Ahmad MK，Khan AA，Mahmood R.Taurine ameliorates potassium bromate-induced kidney damage in rats［J］.Amino Acids，2013，45(5):1109-1121.