一株鴨瘟病毒的分離與鑒定

付書林+陳夏冰+錢運(yùn)國(guó)+張大丙+楊文海+何斌+金爾光+童偉文+葉勝?gòu)?qiáng)+劉武+陶弼菲+陳潔

摘要：從湖北省武漢市某種鴨場(chǎng)送檢的死亡鴨肝臟中分離到1株病毒，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，剖檢病理變化特征初步診斷為鴨瘟病毒感染。根據(jù)GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，提取病毒核酸DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約為416 bp的目的片段。測(cè)序結(jié)果表明與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因的序列相似性達(dá)到99%。鴨胚感染試驗(yàn)表明，感染的鴨胚在第四天開始死亡，并出現(xiàn)典型的鴨瘟病毒感染癥狀。上述結(jié)果表明，該種鴨場(chǎng)種鴨死亡是由鴨瘟病毒所引起的。

關(guān)鍵詞：鴨瘟；鴨瘟病毒；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：S852.65+9.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4644-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.036

Isolation and Identification of One Duck Plague Virus Strain

FU Shu-lin1， CHEN Xia-bing1， QIAN Yun-guo2， ZHANG Da-bing3， YANG Wen-hai1， HE Bin1， JIN Er-guang1， TONG Wei-wen1， YE Sheng-qiang1， LIU Wu1， TAO Bi-fei1， CHEN Jie1

（1. Wuhan Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Wuhan 430208，China； 2.Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 430208， China； 3. College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： One virus strain was isolated from the liver of the dead ducks in a farm of Wuhan city， Hubei province. Combined with epidemiological investigation and autopsy pathology， it was initially diagnosed as duck plague virus infection. Based on the sequences of plague virus gene in GenBank of UL6 gene， one pair of primers was designed and used to PCR amplification of extracted viral nucleic acids DNA. The PCR products were 416 bp and the similarity was 99% compared with the gene sequence of the Duck Plague Virus UL6 gene published. The duck embryo infection experiment showed that duck embryos began to die in the first four days， with typical symptoms of the duck plague virus infection. It is indicated that the case was the infection of duck plague virus.

Key words： duck plague； duck plague virus； isolation； identification

鴨瘟（Duck plague），又名鴨病毒性腸炎（Duck virusenteritis， DVE），是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病[1]。其特征是流行廣泛，傳播較迅速，發(fā)病率和死亡率較高。鴨瘟臨床表現(xiàn)為精神沉郁、高熱稽留、兩腿麻痹、下痢、流淚和部分發(fā)病鴨頭頸腫大[2]。該病病原為鴨瘟病毒（Duck plague virus），屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，核酸類型為線狀雙股DNA[3]。由于對(duì)鴨瘟病毒的分子生物學(xué)研究相對(duì)滯后，基因的功能研究嚴(yán)重滯后，因此目前該病的診斷主要依賴于流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化和病毒的分離、鑒定。但是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)建立了一些分子生物學(xué)方法對(duì)鴨瘟病毒進(jìn)行鑒別診斷。陳安莉等[4]建立了二重PCR方法能夠區(qū)別新城疫病毒和鴨瘟病毒的感染，張艷芳等[5]建立了二重?zé)晒舛縍T-PCR方法區(qū)分鴨黃病毒和鴨瘟病毒的感染。

本研究根據(jù)GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，成功擴(kuò)增出目的基因，并通過鴨胚感染試驗(yàn)證實(shí)了鴨瘟病毒在臨床上的感染。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用9～10日齡櫻桃谷鴨胚由武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所自行孵化；病毒基因組DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；DL Marker 2000、Taq酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料收集與處理 送檢病料來自湖北省武漢市某種鴨場(chǎng)40周齡櫻桃谷種鴨。采集病鴨的肝臟組織搗碎，并按照質(zhì)量體積比1∶5的比例加入無菌的PBS液混勻進(jìn)行組織勻漿，然后以4 000 r/min離心10 min，取上清液并用無菌PBS液稀釋作為接種鴨胚的材料。

1.2.2 病毒DNA提取 取送檢死亡的病鴨肝臟，加入無菌的PBS液進(jìn)行組織勻漿，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，然后按照病毒基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小為416 bp。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系采用25 μL反應(yīng)體系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌水5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

1.2.5 測(cè)序與序列分析 將PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用DNA Star軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的UL6基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6 鴨胚感染試驗(yàn) 將16只9～10日齡的鴨胚隨機(jī)分為2組，每組8只。第一組每只鴨胚接種0.2 mL的病毒稀釋液。第二組每只鴨胚接種0.2 mL的無菌PBS液（陰性對(duì)照）。培養(yǎng)并觀察鴨胚死亡情況和病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨瘟病毒的PCR鑒定結(jié)果

用設(shè)計(jì)合成的針對(duì)鴨瘟病毒UL6基因核苷酸序列擴(kuò)增引物對(duì)提取的鴨瘟病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條約416 bp大小的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.2 鴨瘟病毒UL6基因序列測(cè)定分析結(jié)果

將所測(cè)定的序列通過DNAMAN軟件與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明所鑒定病毒的UL6基因序列與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列的相似性達(dá)到99%（圖2）。

2.3 鴨胚感染試驗(yàn)結(jié)果

接種后4 d，攻毒組的鴨胚開始出現(xiàn)死亡，在第六天8只鴨胚全部死亡，而陰性對(duì)照組的鴨胚沒有出現(xiàn)死亡（圖3）。死亡的鴨胚全身水腫，出血，絨毛尿囊膜有灰白色壞死點(diǎn)，肝臟有壞死灶出現(xiàn)。

3 小結(jié)與討論

鴨瘟病毒在臨床上造成的死亡情況有較大的差別。不同年齡、性別和品種的鴨均易感。鴨瘟病毒感染鴨后，可侵害鴨的多種組織器官，為全身各組織感染和廣泛的組織嗜性創(chuàng)造條件[6]。本研究中送檢的病鴨拉綠色稀糞，泄殖腔嚴(yán)重充血、出血、水腫；食道黏膜出血，肝臟腫大，表面有灰白色的壞死點(diǎn)，心內(nèi)膜與心外膜有出血斑點(diǎn)，這與報(bào)道的鴨瘟的臨床癥狀、病理變化等相一致[7]。進(jìn)一步通過擴(kuò)增鴨瘟的UL6基因和鴨胚感染試驗(yàn)證實(shí)送檢的病例為鴨瘟病毒感染。

鴨瘟病毒的天然宿主為鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染[1]。鴨瘟病毒不能直接使用于雞胚，因此本研究中感染動(dòng)物為鴨胚。在本研究中，感染病毒的鴨胚在感染后4～6 d內(nèi)全部死亡，鴨胚感染后出現(xiàn)典型的鴨瘟病毒感染的病理變化特征。

本研究中根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的鴨瘟病毒UL6基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，通過PCR方法特異性擴(kuò)增出416 bp的片段。將擴(kuò)增出的基因片段與公布的基因序列相比較，兩者的相似性為99%。但是，鴨瘟病毒的UL6基因序列在鴨瘟病毒的致病過程中起何作用還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

[2] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒強(qiáng)毒株感染SPF鴨后動(dòng)態(tài)病理組織學(xué)變化[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（1）：9-15.

[3] 郭玉璞，蔣金書.鴨病[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1988. 21-28.

[4] 陳安莉，謝芝勛，謝麗基，等.新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（11）： 192-195.

[5] 張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨黃病毒和鴨瘟病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)分會(huì)，2013.899-903.

[6] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒對(duì)SPF鴨的致病性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余愛花，楊 陽(yáng)，張寶來，等.鴨瘟病毒YZH株的分離鑒定及其TK基因的序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：133-137.

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小為416 bp。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系采用25 μL反應(yīng)體系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌水5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

1.2.5 測(cè)序與序列分析 將PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用DNA Star軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的UL6基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6 鴨胚感染試驗(yàn) 將16只9～10日齡的鴨胚隨機(jī)分為2組，每組8只。第一組每只鴨胚接種0.2 mL的病毒稀釋液。第二組每只鴨胚接種0.2 mL的無菌PBS液（陰性對(duì)照）。培養(yǎng)并觀察鴨胚死亡情況和病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨瘟病毒的PCR鑒定結(jié)果

用設(shè)計(jì)合成的針對(duì)鴨瘟病毒UL6基因核苷酸序列擴(kuò)增引物對(duì)提取的鴨瘟病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條約416 bp大小的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.2 鴨瘟病毒UL6基因序列測(cè)定分析結(jié)果

將所測(cè)定的序列通過DNAMAN軟件與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明所鑒定病毒的UL6基因序列與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列的相似性達(dá)到99%（圖2）。

2.3 鴨胚感染試驗(yàn)結(jié)果

接種后4 d，攻毒組的鴨胚開始出現(xiàn)死亡，在第六天8只鴨胚全部死亡，而陰性對(duì)照組的鴨胚沒有出現(xiàn)死亡（圖3）。死亡的鴨胚全身水腫，出血，絨毛尿囊膜有灰白色壞死點(diǎn)，肝臟有壞死灶出現(xiàn)。

3 小結(jié)與討論

鴨瘟病毒在臨床上造成的死亡情況有較大的差別。不同年齡、性別和品種的鴨均易感。鴨瘟病毒感染鴨后，可侵害鴨的多種組織器官，為全身各組織感染和廣泛的組織嗜性創(chuàng)造條件[6]。本研究中送檢的病鴨拉綠色稀糞，泄殖腔嚴(yán)重充血、出血、水腫；食道黏膜出血，肝臟腫大，表面有灰白色的壞死點(diǎn)，心內(nèi)膜與心外膜有出血斑點(diǎn)，這與報(bào)道的鴨瘟的臨床癥狀、病理變化等相一致[7]。進(jìn)一步通過擴(kuò)增鴨瘟的UL6基因和鴨胚感染試驗(yàn)證實(shí)送檢的病例為鴨瘟病毒感染。

鴨瘟病毒的天然宿主為鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染[1]。鴨瘟病毒不能直接使用于雞胚，因此本研究中感染動(dòng)物為鴨胚。在本研究中，感染病毒的鴨胚在感染后4～6 d內(nèi)全部死亡，鴨胚感染后出現(xiàn)典型的鴨瘟病毒感染的病理變化特征。

本研究中根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的鴨瘟病毒UL6基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，通過PCR方法特異性擴(kuò)增出416 bp的片段。將擴(kuò)增出的基因片段與公布的基因序列相比較，兩者的相似性為99%。但是，鴨瘟病毒的UL6基因序列在鴨瘟病毒的致病過程中起何作用還有待進(jìn)一步研究。

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[3] 郭玉璞，蔣金書.鴨病[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1988. 21-28.

[4] 陳安莉，謝芝勛，謝麗基，等.新城疫病毒和鴨瘟病毒二重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（11）： 192-195.

[5] 張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨黃病毒和鴨瘟病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)分會(huì)，2013.899-903.

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1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小為416 bp。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系采用25 μL反應(yīng)體系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌水5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

1.2.5 測(cè)序與序列分析 將PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用DNA Star軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的UL6基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6 鴨胚感染試驗(yàn) 將16只9～10日齡的鴨胚隨機(jī)分為2組，每組8只。第一組每只鴨胚接種0.2 mL的病毒稀釋液。第二組每只鴨胚接種0.2 mL的無菌PBS液（陰性對(duì)照）。培養(yǎng)并觀察鴨胚死亡情況和病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨瘟病毒的PCR鑒定結(jié)果

用設(shè)計(jì)合成的針對(duì)鴨瘟病毒UL6基因核苷酸序列擴(kuò)增引物對(duì)提取的鴨瘟病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條約416 bp大小的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.2 鴨瘟病毒UL6基因序列測(cè)定分析結(jié)果

將所測(cè)定的序列通過DNAMAN軟件與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明所鑒定病毒的UL6基因序列與GenBank上公布的鴨瘟病毒UL6基因序列的相似性達(dá)到99%（圖2）。

2.3 鴨胚感染試驗(yàn)結(jié)果

接種后4 d，攻毒組的鴨胚開始出現(xiàn)死亡，在第六天8只鴨胚全部死亡，而陰性對(duì)照組的鴨胚沒有出現(xiàn)死亡（圖3）。死亡的鴨胚全身水腫，出血，絨毛尿囊膜有灰白色壞死點(diǎn)，肝臟有壞死灶出現(xiàn)。

3 小結(jié)與討論

鴨瘟病毒在臨床上造成的死亡情況有較大的差別。不同年齡、性別和品種的鴨均易感。鴨瘟病毒感染鴨后，可侵害鴨的多種組織器官，為全身各組織感染和廣泛的組織嗜性創(chuàng)造條件[6]。本研究中送檢的病鴨拉綠色稀糞，泄殖腔嚴(yán)重充血、出血、水腫；食道黏膜出血，肝臟腫大，表面有灰白色的壞死點(diǎn)，心內(nèi)膜與心外膜有出血斑點(diǎn)，這與報(bào)道的鴨瘟的臨床癥狀、病理變化等相一致[7]。進(jìn)一步通過擴(kuò)增鴨瘟的UL6基因和鴨胚感染試驗(yàn)證實(shí)送檢的病例為鴨瘟病毒感染。

鴨瘟病毒的天然宿主為鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染[1]。鴨瘟病毒不能直接使用于雞胚，因此本研究中感染動(dòng)物為鴨胚。在本研究中，感染病毒的鴨胚在感染后4～6 d內(nèi)全部死亡，鴨胚感染后出現(xiàn)典型的鴨瘟病毒感染的病理變化特征。

本研究中根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的鴨瘟病毒UL6基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，通過PCR方法特異性擴(kuò)增出416 bp的片段。將擴(kuò)增出的基因片段與公布的基因序列相比較，兩者的相似性為99%。但是，鴨瘟病毒的UL6基因序列在鴨瘟病毒的致病過程中起何作用還有待進(jìn)一步研究。

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[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

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[5] 張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨黃病毒和鴨瘟病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)分會(huì)，2013.899-903.

[6] 張 坤，刁有祥，程彥麗，等.鴨瘟病毒對(duì)SPF鴨的致病性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余愛花，楊 陽(yáng)，張寶來，等.鴨瘟病毒YZH株的分離鑒定及其TK基因的序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：133-137.