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    小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增與生物學(xué)特性研究

    2014-12-02 04:23:52劉曉玲郭紅月宋振川
    腫瘤預(yù)防與治療 2014年1期
    關(guān)鍵詞:骨髓細(xì)胞樹突培養(yǎng)液

    劉曉玲,郭紅月,董 猛,宋振川

    (河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,河北滄州061001)

    樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC),也是唯一能將抗原遞呈給初始T細(xì)胞激發(fā)初次免疫應(yīng)答的抗原呈提細(xì)胞,被認(rèn)為是機(jī)體免疫的始動者,在抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著重要作用,基于DC的免疫治療被認(rèn)為是最具前景的抗腫瘤治療[1],本研究采用簡便方法體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠骨髓DCs,為抗腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    SPF級615小鼠,雌雄各半,鼠齡6~8周齡,體重17~21g,購于天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBICO公司)、PBS粉(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)rmIl-4、rmGMCSF、rmTNF-α、FITC 標(biāo)記抗鼠單克隆抗體、PE 標(biāo)記抗鼠CD86單克隆抗體均購于美國BioLegend公司。CO2培養(yǎng)箱(美國 SHELDON)、流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 小鼠骨髓單核細(xì)胞分離 將615小鼠拉頸處死,浸入75%酒精消毒5min,無菌狀態(tài)下取脛骨和股骨,剪掉股骨和脛骨骨兩端,用1ml一次性使用注射器抽取PBS液,刺入骨髓腔反復(fù)沖洗,骨髓細(xì)胞懸液過400目濾網(wǎng)去除組織碎片,收集細(xì)胞懸液離心(1 500r/min,5min),棄上清,以1∶10體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液重懸使紅細(xì)胞裂解,同法PBS液離心清洗2次。

    1.2.2 骨髓源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的培養(yǎng)擴(kuò)增用全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),以RMPI-1640全培養(yǎng)液配成2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,接種于6孔板,每孔中加入完全培養(yǎng)基至4ml,再加入GM-CSF(終質(zhì)量濃度20ng/ml),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。第3天輕輕吹打,吸去培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞,保留貼壁細(xì)胞加入新鮮的等量RMPI-1640全培養(yǎng)液和相同濃度的GM-CSF及終濃度為10ng/ml的IL-4,繼續(xù)培養(yǎng),隔日半量換液,補(bǔ)充RMPI-1640全培養(yǎng)液和GM-CSF及IL-4。繼續(xù)培養(yǎng)至第8天,加入TNF-α(10ng/ml),孵育48小時(shí)收集懸浮細(xì)胞即為成熟的DCs。

    1.2.3 細(xì)胞生長狀態(tài)觀察 每天相差顯微鏡下觀察DC的形態(tài)、數(shù)量、分布、貼壁情況、細(xì)胞集落生長情況并拍照。

    1.2.4 DC細(xì)胞表型流式細(xì)胞術(shù)分析 分別收集加入TNF-α前及加入TNF-α 48小時(shí)后的DC懸液,離心沉淀(1 000r/min,5min),去上清,加PBS 4ml懸垂,再離心2次,用PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×106個(gè)/ml,加入 Eppendorf管,每管 100μl,然后分別加入 FITC anti-mouseCD11c、Peanti-mouseCD86單抗各2μg,4℃避光孵育30min,PBS液洗3次后用,流式細(xì)胞儀檢測各組DC表面CD11c、CD86的表達(dá)情況,將加入TNF-α前后組作為實(shí)驗(yàn)組,未加入抗體的DC組作為對照組,比較其表面標(biāo)志物的表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,DC表型表達(dá)陽性率數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

    經(jīng)分離提純的小鼠骨髓細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí)后相差顯微鏡下可見培養(yǎng)板底部有半貼壁細(xì)胞,少量細(xì)胞集落形成,簇狀生長,細(xì)胞體積小,圓形,細(xì)胞無明顯突起(圖1a);體外培養(yǎng)3天后可見貼壁細(xì)胞逐漸增多,松散粘附于培養(yǎng)板的細(xì)胞集落增多,散在少量DC,半貼壁,細(xì)胞體積有所增大,細(xì)胞核可見,為較小圓或橢圓形,可見貼壁的單核巨噬細(xì)胞(圖1b);第5天可見部分細(xì)胞脫壁,從細(xì)胞集落中釋放出來,呈半貼壁狀態(tài),細(xì)胞體積變大,形態(tài)不規(guī)則,有部分突起,即為未成熟DC(圖1c~圖1e);培養(yǎng)第7天,細(xì)胞體積更大,培養(yǎng)液中有更多懸浮細(xì)胞,細(xì)胞集落散在其中,更加松散,形態(tài)趨于特征性星形,有2~5個(gè)不等的突起,懸浮細(xì)胞為擴(kuò)增之骨髓樹突狀細(xì)胞(圖1f~1g);加入TNF-α 24h后,大量形態(tài)典型的DC從集落釋放,細(xì)胞生長旺盛,體積增大,有明顯樹枝狀突起,突起粗大且長,胞體飽滿,呈星形、多邊形、或梭行(圖1h~1j)。每只615小鼠平均能分離出3×107個(gè)骨髓細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)可獲得7×106個(gè)DC。

    圖1 DC培養(yǎng)觀察圖

    2.2 流式細(xì)胞儀檢測小鼠骨髓DC加入TNF-α前后CD11c及CD86的陽性表達(dá)情況

    將加入TNF-α前后組作為實(shí)驗(yàn)組,將未加抗體的DC作為對照組,結(jié)果顯示,CD11c陽性表達(dá)率加入 TNF-α 前為:(65.09 ±3.04)%(圖 2),加入TNF-α后為:(70.99 ± 1.44)%(圖 3)(χ2=6.625;p=0.097);CD86陽性表達(dá)率加入 TNF-α 前為(25.80±0.30)%(圖 2),加入 TNF-α 后為(55.91 ±2.41)%(圖 3)(χ2=6.856;p=0.032)。CD86 加入TNF-α前陽性表達(dá)率低于加入TNF-α后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CD11c的陽性表達(dá)率加入TNF-α前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。見表1。

    圖2 加入TNF-α前CD11c、CD86陽性表達(dá)率

    圖3 加入TNF-α后CD11c、CD86陽性表達(dá)率

    表1 流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞CD11c CD86陽性表達(dá)率 [(±s)%]

    表1 流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞CD11c CD86陽性表達(dá)率 [(±s)%]

    ◆組與* 組比較,P >0.05(χ2=6.625;p=0.097)▲組與★組比較,P <0.05(χ2=6.856;p=0.032)

    表面標(biāo)志物 加入TNF-α前 加入TNF-α后CD11c 65.09 ±3.04◆ 70.99 ±1.44*CD86 25.80 ±0.30▲ 55.91 ±2.41★

    3 討論

    樹突狀細(xì)胞是由Steinman和Cohn首先由小鼠脾臟組織中分離發(fā)現(xiàn)的,因其具有典型的樹突狀突起而命名[2]。在接受抗原刺激成熟后,DC可以有效地?cái)z取抗原,并通過抗原肽/MHC分子復(fù)合物的形式,將抗原有效提呈給初始T細(xì)胞,刺激生成針對該抗原的特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞,從而有效啟動機(jī)體免疫反應(yīng)[3]。目前,已能夠通過體外抗原沖擊、基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合等方法制備出相應(yīng)的DCs腫瘤疫苗,并且在動物實(shí)驗(yàn)中獲得很好的效果[4-6]。

    DC主要來源于骨髓的CD34+造血干細(xì)胞,故可以從骨髓細(xì)胞中分離誘導(dǎo)DC,獲得一定量有功能的DC是深入研究其生物學(xué)功能的關(guān)鍵,然而DC在體內(nèi)分布分散,含量極低,在動物和人外周血中尚不足白細(xì)胞總量的1%,在實(shí)質(zhì)器官中低于局部細(xì)胞1%,在血液中低于有核細(xì)胞的0.1%,故如何體外大量擴(kuò)增DCs成為研究者目前急需解決的問題[7]。

    在小鼠DC的體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增中添加細(xì)胞因子是最重要的環(huán)節(jié),GM-CSF是維持DC發(fā)育及分化最根本的細(xì)胞因子,但是單一使用GM-CSF只能產(chǎn)生少量的DC集落,并且還會刺激骨髓細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量增殖,影響DC純度,而IL-4能抑制培養(yǎng)物中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生,并能使DC具有典型形態(tài)和很強(qiáng)的處理外源性抗原能力[8]。通過聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF和IL-4進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7天時(shí),加入脂多糖(LPS)繼續(xù)培養(yǎng)24h,能獲得大量成熟 DCs[9]。

    在本研究開始,GM-CSF及IL-4濃度配比較低,骨髓細(xì)胞生長緩慢,調(diào)整GM-CSF濃度至20ng/ml,IL-4濃度至10ng/ml,細(xì)胞數(shù)量增多,體積增大。本實(shí)驗(yàn)在第三天開始加入IL-4,而不是在本實(shí)驗(yàn)開始前加入,是考慮IL-4與GM-CSF作用相抵觸之處。TNF-α能抑制粒細(xì)胞的產(chǎn)生,同時(shí)誘導(dǎo) DC的成熟[10],可以將成熟的DC數(shù)量提高10%~15%。

    由于DC來源復(fù)雜,到目前為止,還沒有發(fā)現(xiàn)一種表面分子能夠代表不同組織及不同分化時(shí)期的所有DC的特異性標(biāo)記,目前通常采用細(xì)胞形態(tài)、表型及異基因淋巴細(xì)胞刺激能力三者相結(jié)合的方法。

    據(jù)報(bào)道33D1、凝集素類似受體 NLDC-k145、DEC-205及整合素CD11c[11]被認(rèn)為是小鼠DC較特異性的表面標(biāo)記,在這3種表面分子中,CD11c是相對分子質(zhì)量為150 000的β2整合素家族成員,髓樣樹突狀細(xì)胞表達(dá)髓源性抗原CD11c,CD11c是確定DCs特異性表面標(biāo)志物之一,與CD86相比,包括DC前體、未成熟及活化成熟的DC均有較高的表達(dá)率[12]。CD86是細(xì)胞表面黏附因子,也是激活T細(xì)胞的第2信號分子,可作為DC的活性指標(biāo)[13]。

    不成熟DC具有很強(qiáng)的吞噬、加工處理抗原的能力,但是對T細(xì)胞的刺激功能比較低,其表面低表達(dá)甚至不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子如CD40、CD80和CD86。未成熟DCs捕獲抗原后,并在一些活化因子(如 LPS、IL-1β、TNF-α 等)作用下可分化為成熟DCs,其表面MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子的表達(dá)顯著上調(diào),其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng),對T細(xì)胞的刺激功能增加,但抗原攝取能力下降[14]。

    本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,CD11c添加TNF-α前后的陽性表達(dá)率無差別,CD86加入TNF-α后陽性表達(dá)率較加入 TNF-α前明顯增加。說明未成熟DC和成熟DC,CD11c均有較高表達(dá),成熟DC較未成熟DC,CD11c表達(dá)無明顯增高,說明CD11c是DC的特異性表面標(biāo)志物,CD86在成熟DC表達(dá)較未成熟DC高。說明TNF-α能提高CD34+干細(xì)胞表面GM-CSF受體數(shù)量,促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)CD86,阻斷粒細(xì)胞分化途徑,促進(jìn)DC分化、成熟[15]。

    本實(shí)驗(yàn)經(jīng)rmGM-CSF和rmIL-4聯(lián)合誘導(dǎo),可以從小鼠骨髓獲得大量具有典型DC形態(tài)學(xué)特征及生物學(xué)特征的樹突狀細(xì)胞,這為DC疫苗的研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    [1] 徐 榕,江虹虹,宋海峰.樹突狀細(xì)胞疫苗研究的新策略[J].中國腫瘤,2011,20(2):92-97.

    [2] Steinman RM,Chon ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice.Imorphology,quantitation,tissue distribution[J].Exp Med,1973,137(5):1142-1162.

    [3] Chauvin C,Josien R.Dendritic cells as killers:mechanistic aspects and potential roles[J].J Immunol,2008,139(5):671-676.

    [4] Brok MH,Nierkens S,F(xiàn)igdor CG,et al.Dendritic cells:tools and targets for antitumor vaccination[J].Expert Rev Vaccines,2005,5(4):699-710.

    [5] Banchereau J,Palucka AK.Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer[J].Nat Rev Immunol,2005,5(4):296-306.

    [6] Gong J,Koido S,Calderwood SK.Cell fusion:from hybridoma to dendritic cell-based vaccine[J].Expert Rev Immunol,2008,7(7):1055-1068.

    [7] 易輝君,盧光琇.不同來源血清或血漿培養(yǎng)條件下的樹突狀細(xì)胞表型和功能的比較[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(6):561-563.

    [8] 郭慈仁,歐啟水,李良慶.小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增和鑒定[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,38(3):261-263

    [9] 劉 錚,代繼宏,符 州,等.小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及初步鑒定[J]。南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(2):25-31.

    [10]孫國龍,王凱忠,周 莉,等.小鼠骨髓及脾臟來源的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(3):408-411

    [11] Makala LH,Nishikawa Y,Mishima M,et al.Phenotype and unction of murine peritoneal cavity macrophage derived dendriticells[J].J Vet Med Sci,2002,64(9):813-820

    [12] Reschner A,Hubert P,Delvenne P,et al.Innate lymphocyte and dendritic cell cross-talk:a key factor in the regulation of the immune response[J].Clin Exp Immunol,2008,152:219-226.

    [13] Guermonp rez P,Valladeau J,Zitvogel L,et al.Antigen p resentation and T cell stimulation by dendritic cells[J].Immunol,2002,20:621-667.

    [14] Liu Q,Shu X,Sun A,et al.Plant-derived small molecule albaconol suppresses LPS triggered proinflammatory cytokine production and antigen presentation of dendritic cells by impairing NF-kB activation [J].Int Immunopharmacol,2008,8:1103-1111.

    [15]熊 菲.影響樹突狀細(xì)胞分化成熟因素的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊,2005,28(2):107-111.

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