腦損傷和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對(duì)大鼠脛骨骨折愈合過程中5-HT、VEGF的影響*

季衛(wèi)鋒 傅永波 陸吳超

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006；2.浙江省諸暨市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 諸暨 311800；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

多年來人們?cè)谂R床實(shí)踐中觀察到骨折合并腦外傷患者骨痂過度生長(zhǎng)，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，比單純骨折患者愈合速度明顯加快。自Roberts［1］于1968年首次報(bào)告腦外傷后出現(xiàn)異位骨化，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)骨折合并腦外傷的骨折愈合和異位骨化進(jìn)行了研究。 Bose M［2］等研究發(fā)現(xiàn)合并腦外傷的大鼠股骨干骨折愈合時(shí)間明顯短于單純股骨干骨折組。Zwerina J［3］等發(fā)現(xiàn)骨折伴腦外傷者骨折愈合過程中出現(xiàn)大量骨痂，骨折愈合加快。中醫(yī)古籍《本草經(jīng)疏》有記載“補(bǔ)骨脂，能暖水臟，陰中生陽(yáng)，壯火益士之要藥也”，補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、固精縮尿的功效。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)補(bǔ)骨脂提取物的研究也很多，宋芹［4］等研究表明補(bǔ)骨脂提取物具有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用。楊榮平［5］等研究表明補(bǔ)骨脂乙酸乙酯提取物和乙醇提取物均可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖。Wong RW［6］等研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂提取物口服能增加骨密度和骨的組織形態(tài)學(xué)改變。

臨床上補(bǔ)骨脂對(duì)于治療骨折、股骨頭壞死及骨質(zhì)疏松有良好的療效，而骨折合并腦外傷的患者又有明顯加快骨折愈合的作用。國(guó)內(nèi)外雖然關(guān)于研究骨折愈合的文章很多，但是對(duì)于腦外傷及中藥單體如何促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠脛骨骨折愈合的研究，比較腦外傷及補(bǔ)骨脂二氫黃酮對(duì)骨折愈合過程中5-羥色胺（5-HT）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）含量的大小，闡明腦外傷及中藥促進(jìn)骨折愈合機(jī)理的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠42只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，雄性。浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無特定病原體動(dòng)物（SPF）級(jí)環(huán)境下，室內(nèi)定期進(jìn)行紫外線照射殺菌，籠具、墊料、飲水、飼料等均嚴(yán)格消毒。

1.2 試藥與儀器 10%濃度的水合氯醛，聚維酮碘消毒液，無水酒精，青霉素，生理鹽水，VEGF、5-HT ELISA試劑盒各1個(gè)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮（粉劑，購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)前保存于-15℃的冰箱內(nèi)）。高壓蒸汽滅菌鍋、自動(dòng)平衡離心機(jī)LDZ5-2、電動(dòng)鉆孔器、電熱恒溫水浴器DK-S24型、超低溫冰箱、電子天平、熱風(fēng)循環(huán)烘箱、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、微量高速離心機(jī)；手術(shù)剪、止血鉗鑷、眼科剪鑷、注射器、燒杯、量筒、試管、離心管、濾膜、25 cm長(zhǎng)空心導(dǎo)管、20 g砝碼、直徑5 mm磁性墊片、eppendorf管、手術(shù)縫針、外科縫線等。

1.3 分組與給藥 選擇清潔成年雄性SD大鼠42只，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g。將其隨機(jī)分為 7 組：正常對(duì)照組6只，腦損傷組6只，骨折組6只，腦損傷+骨折組6只、補(bǔ)骨脂二氫黃酮+骨折組按補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥的劑量分大劑量組、中劑量組、小劑量組各6只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3只。

1.4 模型制備 （1）中度腦損傷模型制備：術(shù)前所有大鼠禁食1d，稱體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔麻醉（3mL/kg）后，消毒，鋪單，自大鼠頭頂正中縱行切一長(zhǎng)1.5 cm切口，向兩側(cè)分離皮膚，切開骨膜，露出右側(cè)顱頂骨約0.8 cm。以中線旁2 mm，前囟后1.5 mm處為中心鉆孔，開直徑約5 mm骨窗，將20 g砝碼于30 cm高處通過導(dǎo)管墜落，撞擊置于硬膜上的墊片致中度腦損傷。止血，聚維酮碘浸泡，縫合頭皮，術(shù)畢。術(shù)后給予青霉素注射液肌肉注射，用生理鹽水配制成80000 U/mL），每只大鼠40000 U，連續(xù)3 d。（2）脛骨骨折模型制備：將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg）后，沿脛骨前外側(cè)鈍性分離進(jìn)入到達(dá)脛骨干，在脛骨結(jié)節(jié)下1 cm處用擺鋸鋸斷脛骨成橫形骨折，以直徑1 mm克氏針作逆行髓內(nèi)固定，經(jīng)查骨折固定牢固后，生理鹽水沖洗，關(guān)閉傷口，聚維酮碘消毒。術(shù)后給予青霉素肌肉注射，用生理鹽水配制成80000 U/mL，每只大鼠予40000 U，連續(xù)3 d。（3）腦損傷組+脛骨骨折組造模：同上兩組組合。補(bǔ)骨脂二氫黃酮+骨折組造模：同前脛骨骨折模型；高劑量組：以大鼠每100 g體質(zhì)量腹腔注射，1.5 mg補(bǔ)骨脂二氫黃酮，每周2次；中劑量組：以大鼠每100 g體質(zhì)量腹腔注射，0.5 mg，每周2次；低劑量組：以大鼠每100 g體質(zhì)量腹腔注射，0.1 mg，每周2次。正常對(duì)照組不作任何處理。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 正常對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)開始后第3日，其他6組均于術(shù)后3 d，1周，2周，3周，4周，5周取血。實(shí)驗(yàn)采用眼眶取血方法，每次每只大鼠取血約2 mL，將抽取的血液注入消毒過的eppendorf管中，放入裝有冰袋的泡沫盒中冷藏。全部取完后，將血液于低溫條件 （4℃）的冰箱中放置4 h后，3000 r/min離心10min后取上清液，再將上清液過濾除菌后分裝凍存（2 mL/支、-80℃）。 大鼠血清中 VEGF、5-HT 的含量采用ELISA測(cè)定法。（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)液按照等體積稀釋5倍后，取液備用。（2）加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。（3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。（6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μL，空白孔除外。（7）溫育：操作同 3。（8）洗滌：操作同 5。（9）顯色：每孔先加入顯色劑 A 50 μL，再加入顯色劑 B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。（10）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。（11）測(cè)定：以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠死亡情況 在實(shí)驗(yàn)造模過程中，正常對(duì)照組有1只大鼠在麻醉時(shí)死亡，腦損傷組和腦損傷+骨折組在實(shí)驗(yàn)過程中各死亡1只，補(bǔ)骨脂二氫黃酮大劑量組死亡1只，總的實(shí)驗(yàn)大鼠樣本為38只。

2.2 取血離心后各組血清5-HT水平比較 見表1。腦損傷組、骨折+腦損傷組在1周時(shí)5-HT水平達(dá)最低，1周后濃度呈緩慢上升趨勢(shì)，4周后逐漸平穩(wěn)；而骨折+補(bǔ)骨脂二氫黃酮3個(gè)劑量組5-HT水平在5周內(nèi)只有輕微波動(dòng)，與骨折組在第3日、在1周、2周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 取血離心后各組血清5-HT水平比較（ng/L，）

與正常對(duì)照組同時(shí)期比較，*P＜0.05；與骨折組同時(shí)期比較比較，△P＜0.05；與腦損傷組同時(shí)期比較，▲P＜0.05。下同。

2.3 各組血清VEGF水平比較 見表2?？梢钥闯龈鲗?shí)驗(yàn)組濃度較正常對(duì)照組高，骨折+腦損傷組水平高于單純骨折組和單純腦損傷組，3周后呈下降趨勢(shì)；骨折+補(bǔ)骨脂二氫黃酮3個(gè)劑量組在1周后，VEGF水平與補(bǔ)骨脂二氫黃酮?jiǎng)┝砍烧龋?周后均趨向相同水平。

3 討 論

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜有序且漫長(zhǎng)的過程，該過程中有眾多因子參與調(diào)控，受多種因素影響。在臨床實(shí)踐中骨折合并腦外傷的患者骨痂過度生長(zhǎng)，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，骨折愈合明顯加快。早在1987年P(guān)erkins［7］發(fā)現(xiàn)合并腦外傷骨折患者骨折處骨痂顯著增加，并且愈合時(shí)間平均縮短了 4周。Spencer［8］通過研究也得出了相似的結(jié)論，并通過對(duì)骨痂組織學(xué)分析顯示骨痂的特征。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，在骨折愈合過程中起著重要作用［9］。5-HT是一種吲哚衍生物，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。嚴(yán)穎彬［10］發(fā)現(xiàn)外周合成的5-HT可充當(dāng)激素抑制骨形成，抑制外周5-HT的合成可能成為一種通過增強(qiáng)骨的合成代謝治療骨質(zhì)疏松的新型方法。

表2 各組血清VEGF水平比較（pg/L，）

表2 各組血清VEGF水平比較（pg/L，）

傳統(tǒng)骨折愈合過程分為4期，即血腫形成期，纖維骨痂形成期，骨性骨痂形成期和骨痂改造重塑期。在愈合過程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)受到不良影響均會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合或骨折不愈合。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，在骨折愈合過程中，近年來通過研究發(fā)現(xiàn)了越來越多起重要作用的骨折生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，5-羥色胺等，中醫(yī)藥對(duì)骨折愈合的影響也正逐步走向細(xì)胞分子水平，尤其是中藥無論是單味藥還是復(fù)方對(duì)骨折生長(zhǎng)因子的影響逐步受到重視。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠脛骨骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究，比較腦外傷及補(bǔ)骨脂二氫黃酮對(duì)骨折愈合中5-HT、VEGF因子含量的大小，發(fā)現(xiàn)單純骨折組大鼠血清中VEGF含量在手術(shù)后3 d較少，2周出現(xiàn)峰值，隨后呈下降趨勢(shì)，這與武永剛［11］等研究結(jié)果相符。他們認(rèn)為骨折后早期（5～7 d）骨折局部由于出血、組織細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞反應(yīng)引起了血流中斷、此時(shí)VEGF表達(dá)量較弱。隨著骨折修復(fù)，肉芽組織增長(zhǎng)加快使得血供相對(duì)較少，大約在骨折后2周VEGF mRNA表達(dá)量達(dá)最高，而在骨折修復(fù)后期表達(dá)呈下滑趨勢(shì)。腦損傷組和骨折+腦損傷組的大鼠血清中VEGF含量同樣在2周時(shí)達(dá)到峰值，但明顯高于單純骨折組，2周后也呈下降趨勢(shì)。沈峰等［12］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦外傷合并骨折患者愈合過程中VEGF在血清含量和骨折局部位點(diǎn)表達(dá)高于單純骨折者，他們認(rèn)為腦外傷后繼發(fā)性病理?yè)p害引起的腦組織缺血缺氧，誘導(dǎo)腦挫傷灶周圍腦組織VEGF基因表達(dá)增高，血液、腦脊液中VEGF濃度升高，通過腦外傷后破壞的血-腦脊液屏障進(jìn)入血液，使外周血中VEGF含量增高。骨折+補(bǔ)骨脂二氫黃酮3個(gè)劑量組進(jìn)行兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中、大劑量組在2周后血清VEGF含量高于小劑量組，略呈下降趨勢(shì)，3周后血清含量高于其他各組。臨床應(yīng)用［13］及現(xiàn)代藥理研究結(jié)果都表明補(bǔ)骨脂有強(qiáng)筋骨，防治骨質(zhì)疏松的作用，補(bǔ)骨脂提取物能促進(jìn)骨再生和重建。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［14］，100 μmol/mL的補(bǔ)骨脂異黃酮和10 μmol/mL的補(bǔ)骨脂二氫黃酮就可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，抑制骨的吸收。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看出，補(bǔ)骨脂二氫黃酮進(jìn)入血液后，很可能刺激誘導(dǎo)外周VEGF基因表達(dá)，使外周血液中VEGF濃度維持在較高水平，直接促進(jìn)骨折愈合。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，腦損傷組及骨折+腦損傷組血清中5-HT水平在1周時(shí)達(dá)最高，1周后呈下降趨勢(shì)；其余各組均是緩慢下降趨勢(shì)。彭瑞云等［15］發(fā)現(xiàn)5-羥色胺參與大鼠腦組織損傷的病理過程，5-羥色胺在傷后1 d后表達(dá)增強(qiáng)，3 d達(dá)高峰，7 d后開始減少，而于14 d后逐漸恢復(fù)至正常水平。另外，Tsuiki等［16］用放射自顯影技術(shù)，在大鼠腦皮質(zhì)冷凍損傷模型中也發(fā)現(xiàn)，腦損傷后3 d，傷側(cè)中縫背核、大部分皮質(zhì)區(qū)和背側(cè)海馬5-HT合成率顯著升高，同時(shí)伴隨血腦屏障通透性增高。目前5-HT對(duì)于骨的調(diào)節(jié)作用尚處于試驗(yàn)階段，初步認(rèn)為當(dāng)由周圍產(chǎn)生時(shí)，5-HT作為激素能抑制骨的形成，相反在腦里產(chǎn)生時(shí)，血清素作為神經(jīng)遞質(zhì)在骨量增長(zhǎng)方面可以通過增加骨形成和限制骨吸收而發(fā)揮著一個(gè)積極效應(yīng)。但在腦外傷合并骨折過程中5-HT的合成、釋放、再吸收以及細(xì)胞外的功能依然未知。通過本實(shí)驗(yàn)，筆者猜測(cè)腦損傷早期5-HT神經(jīng)遞質(zhì)合成增加并大量釋放入腦微血管，促進(jìn)骨折愈合，中后期5-HT通過血腦屏障進(jìn)入外周血管，使中樞5-HT水平下降，骨折愈合速率減慢。骨折+補(bǔ)骨脂二氫黃酮3個(gè)劑量組與骨折組在第3日、在1周、2周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步推斷補(bǔ)骨脂二氫黃酮在促進(jìn)骨折愈合過程中對(duì)5-HT水平改變無明顯影響。

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