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    MSAP熒光檢測初始數(shù)據(jù)的自動分析研究

    2014-11-29 04:16:02陳秋博鄒智元李金龍張競濤徐青
    生物技術(shù)通訊 2014年4期
    關(guān)鍵詞:泳道甲基化基因組

    陳秋博,鄒智元,李金龍,張競濤,徐青

    北京交通大學(xué) a.生命科學(xué)與生物工程研究院;b.軟件學(xué)院;北京 100044

    DNA 甲基化是真核細(xì)胞基因組重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一,能在DNA 序列不發(fā)生變化的前提下調(diào)控基因的表達(dá)[1]。DNA 甲基化修飾主要發(fā)生在基因組CCGG 位點(diǎn)[2-3],與細(xì)胞分化、染色體失活及基因印記等生物學(xué)過程密切相關(guān)[4]。目前,檢測DNA 甲基化的方法主要有酶切法、亞硫酸鹽測序法、甲基化特異性PCR、基因組限制性酶切掃描法等。其中,以酶切和PCR 為基礎(chǔ)的甲基化敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)不但敏感性強(qiáng),而且只需要常規(guī)的儀器,操作比較簡單,適用于沒有任何信息的全基因組水平的甲基化分析。MSAP 方法由擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)方法改進(jìn)而來[5],隨后被廣泛應(yīng)用于動植物基因組甲基化相關(guān)研究中。過去,一般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染方法檢測MSAP的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物,但因PAGE 法存在操作復(fù)雜、檢測通量低和分析時間長等缺點(diǎn),逐漸被以熒光標(biāo)記為基礎(chǔ)的測序膠和毛細(xì)管電泳技術(shù)所替代。

    隨著自動化程度和靈敏度的增強(qiáng),毛細(xì)管電泳技術(shù)可以更靈敏、更有效、更高通量地獲得MSAP 的檢測數(shù)據(jù)。例如,本課題組使用以毛細(xì)管電泳技術(shù)為基礎(chǔ)的ABI 3730xl 遺傳分析儀,平均90 min 內(nèi)可以獲得96 泳道的熒光初始檢測數(shù)據(jù),與傳統(tǒng)方法相比,檢測時間縮短至約1/12,但產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量龐大,約為PAGE-銀染檢測的8~10 倍。如果每條泳道平均產(chǎn)生200 條數(shù)據(jù),那么96 泳道可產(chǎn)生近20 000 條數(shù)據(jù),而往往一個普通的實(shí)驗(yàn)設(shè)計需要檢測約10 個96 泳道。如此巨大的數(shù)據(jù)量如果依賴傳統(tǒng)的人工手動分析,幾乎不可能完成。因此,為了建立能夠?qū)崿F(xiàn)MSAP 熒光檢測初始數(shù)據(jù)自動分析的方法,我們采用毛細(xì)管電泳熒光MSAP 檢測技術(shù),分析了北京油雞基因組的甲基化程度,對產(chǎn)生的MSAP 初始數(shù)據(jù)采用標(biāo)準(zhǔn)的人工轉(zhuǎn)換方法及3 種不同的計算機(jī)自動轉(zhuǎn)換方法進(jìn)行處理,比較和分析了人工轉(zhuǎn)換方法和計算機(jī)自動轉(zhuǎn)換方法獲得的結(jié)果,確定了能夠替代人工轉(zhuǎn)換方法的自動轉(zhuǎn)換方法,從而實(shí)現(xiàn)了MSAP 熒光檢測初始數(shù)據(jù)的自動分析,并進(jìn)行編程,創(chuàng)建了適用于MSAP 熒光檢測初始數(shù)據(jù)自動分析的在線軟件。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    選擇10只17周齡北京油雞作為實(shí)驗(yàn)材料,提取基因組DNA。接頭與引物序列設(shè)計參照徐青等[6]方法,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.2 方法

    MSAP 方法包括酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)、擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測共4 個主要步驟。本實(shí)驗(yàn)中,酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)條件與徐青等[6]所用條件相同。

    毛細(xì)管電泳熒光檢測與數(shù)據(jù)分析方法如下:在96 孔板的各孔中分別加入3μL 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物、6.67μL甲酰胺、0.33μL ROX800分子量內(nèi)標(biāo),95℃變性5 min,冰上放置10 min,離心1 min,在ABI 3730xl DNA 分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳(10 kV 預(yù)電泳1 min,3 kV 進(jìn)樣15 s,10 kV 電泳70 min),收集初始數(shù)據(jù),系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中的ROX800 分子量內(nèi)標(biāo)做比較,通過GeneMapper 4.0軟件對收集的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 MSAP 擴(kuò)增片段熒光信號的轉(zhuǎn)換和初始數(shù)據(jù)的獲得

    應(yīng)用GeneMapper 4.0 軟件將MSAP 擴(kuò)增片段熒光檢測信號轉(zhuǎn)換為MSAP 擴(kuò)增片段的實(shí)體數(shù)據(jù)。首先對所有泳道的分子量內(nèi)標(biāo)的熒光圖譜進(jìn)行校正,依據(jù)每個泳道校正后的內(nèi)標(biāo)獲得相應(yīng)泳道的所有MSAP 擴(kuò)增DNA 片段的大小,將結(jié)果導(dǎo)至Excel 表格中。Excel 表格的初始數(shù)據(jù)包括峰位置(Size)、峰高值(Height)、峰面積(Area)和數(shù)據(jù)點(diǎn)(Data Point)等4項(xiàng)有效數(shù)據(jù)。其中,Height是MSAP擴(kuò)增片段的熒光信號強(qiáng)度,代表擴(kuò)增片段的拷貝數(shù),在本研究中,Height 的閾值設(shè)為50,熒光強(qiáng)度小于50 的片段不予考慮。Size表示檢測樣品MSAP擴(kuò)增片段的長度,基本上為非整數(shù)值。在實(shí)驗(yàn)樣品的MSAP 熒光圖譜上,擴(kuò)增片段集中在50~800 bp,所以隨后的數(shù)據(jù)分析只統(tǒng)計長度為50~800 bp 的片段。在本研究中,定義Size≥50 的值為擴(kuò)增產(chǎn)物在該位點(diǎn)出現(xiàn),而Size=0 或不出現(xiàn)為擴(kuò)增產(chǎn)物在該位點(diǎn)缺失。這樣,通過定義Height和Size 值的區(qū)間,對Excel 表格的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,獲得用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣品DNA 甲基化分析的初始數(shù)據(jù),如圖1A所示。

    2.2 MSAP熒光標(biāo)記檢測初始數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換

    2.2.1 MSAP 熒光標(biāo)記檢測初始數(shù)據(jù)的人工轉(zhuǎn)換在MSAP 圖譜上,每個樣本基因組對應(yīng)2 條泳道,其中H 泳道是用HpaⅡ和EcoRⅠ處理的組織DNA 樣品,M 泳道是用MspⅠ和EcoRⅠ處理的組織DNA 樣品。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在2 條泳道出現(xiàn)的情況,個體基因組甲基化帶型可分為3 種:TypeⅠ為非甲基化模式(條帶在H和M 泳道同時出現(xiàn)),TypeⅡ?yàn)槿谆J剑l帶在M 泳道出現(xiàn)而在H 泳道缺失),TypeⅢ為半甲基化模式(條帶在H 泳道出現(xiàn)而在M 泳道缺失)。個體基因組的甲基化水平為TypeⅡ+TypeⅢ與TypeⅠ+TypeⅡ+TypeⅢ的比值。

    在MSAP 圖譜中,H和M 泳道的擴(kuò)增片段對應(yīng)于MSAP 熒光標(biāo)記檢測初始數(shù)據(jù)表中的H和M 數(shù)據(jù)列的Size 值。如圖1A 所示,初始數(shù)據(jù)中每個擴(kuò)增片段的Size 值幾乎全為非整數(shù)值,而實(shí)際擴(kuò)增片段應(yīng)為整數(shù)值,所以初始數(shù)據(jù)的非整數(shù)Size 值要轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的整數(shù)Size 值。初始數(shù)據(jù)Size 值的轉(zhuǎn)換處理對于樣品基因組的甲基化水平估算具有非常大的影響。在本研究中,我們定義人工轉(zhuǎn)換為初始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)處理。如圖1C 所示,初始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換是通過直接比對樣本毛細(xì)管電泳的熒光吸收峰圖譜和MSAP 熒光標(biāo)記檢測初始數(shù)據(jù)Excel 表格中的Size值,來確認(rèn)每個擴(kuò)增位點(diǎn)H和M 數(shù)據(jù)列的Size 值的有或無。MSAP 檢測中,每個樣品每對引物每條泳道平均獲得約200 條目的峰,完成1 個樣品10 對引物獲得的MSAP 熒光標(biāo)記檢測初始數(shù)據(jù)的直接轉(zhuǎn)換需要大約3 h。

    2.2.2 MSAP 熒光標(biāo)記檢測初始數(shù)據(jù)的自動轉(zhuǎn)換由于人工轉(zhuǎn)換是對樣本毛細(xì)管電泳的熒光吸收峰圖譜進(jìn)行一一比對來確定初始數(shù)據(jù)Excel 表格中的Size 值的有無,所以是最準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)換方法。當(dāng)樣品數(shù)量較少時,可以采用這種方法。但是,在實(shí)際研究中,為了獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果,樣本量需要達(dá)到一定規(guī)模。大的樣本量獲得的初始數(shù)據(jù)量非常龐大,人工轉(zhuǎn)換需要大量時間,很難完成。以人工轉(zhuǎn)換方法獲得的甲基化水平數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn),我們設(shè)計了3 種可通過計算機(jī)編程實(shí)現(xiàn)初始數(shù)據(jù)自動轉(zhuǎn)換的方法,用于替代人工轉(zhuǎn)換方法。這3 種方法可通過計算機(jī)編程實(shí)現(xiàn)初始數(shù)據(jù)自動轉(zhuǎn)換,確定實(shí)驗(yàn)樣品基因組對應(yīng)位點(diǎn)的甲基化帶型,計算實(shí)驗(yàn)樣品基因組的甲基化水平。

    2.2.2.1 直接取整法 將所有Size 值四舍五入為整數(shù)值,判斷每一位點(diǎn)H和M 泳道Size 值的有無,確定該位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。直接取整法的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換流程為:程序讀取初始數(shù)據(jù)→實(shí)現(xiàn)所有位點(diǎn)Size 值的取整→設(shè)置每條泳道中50~800長度為1的區(qū)間依次遞增標(biāo)識→將取整后Size 值填入對應(yīng)標(biāo)記的位置中→計算甲基化水平。如圖2DI所示,M 列中172這一值應(yīng)當(dāng)填入?yún)^(qū)間171,但是由于取整丟失了數(shù)據(jù)精確度,所以存在一定缺陷。

    2.2.2.2 整區(qū)間放置法 將直接取整法的泳道整數(shù)位置標(biāo)識調(diào)整為區(qū)間位置標(biāo)識,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換流程為:程序讀取初始數(shù)據(jù)→設(shè)置每條泳道中50.00~800.99 長度為1 的區(qū)間依次遞增標(biāo)識→初始Size 值直接填入所屬區(qū)間標(biāo)識的位置中→程序智能校正填入的初始Size 值,處理重復(fù)的Size 值→計算甲基化水平。整區(qū)間放置法沒有對初始Size 值直接進(jìn)行四舍五入,所以保留了數(shù)據(jù)精度,從而可以使用程序?qū)ize 值進(jìn)行智能校正。如圖2WR 所示,M 列中167.91 應(yīng)當(dāng)填入?yún)^(qū)間167.00~167.99,但167.91 與168.07 的差值小于0.5,經(jīng)過智能校正,該值被填入?yún)^(qū)間168.00~168.99。168.9和169.89同樣是這種情況。

    2.2.2.3 半?yún)^(qū)間放置法 與整區(qū)間放置法的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換流程相同,但對泳道區(qū)間位置標(biāo)識進(jìn)行了調(diào)整。每條泳道中的位置從49.50 到800.50 用長度為1.00的區(qū)間依次標(biāo)識。如圖2HR 所示,M 列中171.88 應(yīng)當(dāng)填入?yún)^(qū)間171.50~172.50,但171.88 與171.48 的差值小于0.5,經(jīng)過智能校正,該值被填入170.50~171.50區(qū)間。

    在后文中,用4 種處理方法的英文單詞首字母縮寫代表這4 種方法。AA 為人工分析法,DI為直接取整法,WR為整區(qū)間放置法,HR為半?yún)^(qū)間放置法。

    2.3 4種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法計算結(jié)果比較

    圖1 初始數(shù)據(jù)人工轉(zhuǎn)換流程圖

    圖2 4種方法泳道位置標(biāo)識及峰位置值填入

    北京油雞基因組DNA甲基化程度MSAP熒光檢測初始數(shù)據(jù)通過人工轉(zhuǎn)換和3 種自動轉(zhuǎn)換方法進(jìn)行分析,4 種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法處理結(jié)果見表1。方差分析顯示,對于非甲基化位點(diǎn)和半甲基化位點(diǎn)的分析,4種轉(zhuǎn)換方法獲得的結(jié)果存在顯著差異(P<0.05);對于全甲基化位點(diǎn),4 種轉(zhuǎn)換方法獲得的結(jié)果沒有顯著差異。Duncan 多重比較分析顯示,對于非甲基化位點(diǎn)和全甲基化位點(diǎn)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,DI 與其他3 種方法之間差異顯著(P<0.05),而AA、WR和HR 三種方法之間沒有顯著差異,HR 與AA 方法之間差異最小。綜合以上結(jié)果,對于MSAP 熒光檢測初始數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換,與AA 標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換相比,HR 轉(zhuǎn)換結(jié)果與AA 最接近,WR 次之,DI 差異最大達(dá)顯著水平(P<0.05),所以在處理較大量的數(shù)據(jù)時,可以采用HR和WR 來替代AA方法,不建議使用DI方法。

    2.4 用于MSAP熒光檢測初始數(shù)據(jù)的自動分析的程序編寫

    MSAP 方法已被廣泛應(yīng)用于動植物基因組的甲基化研究。隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)在MSAP 上的應(yīng)用,越來越龐大的數(shù)據(jù)量使研究人員的分析遇到了難題,初始數(shù)據(jù)的計算機(jī)自動化處理已成為高通量MSAP 分析的迫切需要。目前一些公司提供的熒光圖譜收集儀器和配套軟件已經(jīng)初步使初始數(shù)據(jù)的獲得自動化,但是在獲得這些數(shù)據(jù)之后,研究人員應(yīng)結(jié)合實(shí)際意義進(jìn)行二次處理,目前還沒有此類成型軟件。為了解決這個問題,結(jié)合本研究分析結(jié)果,我們在半?yún)^(qū)間放置法的基礎(chǔ)上編寫了一個數(shù)據(jù)分析軟件——MSAP Analyst。

    該軟件采用Microsoft.Net 4.0架構(gòu),使用C#語言開發(fā)。軟件分為界面模塊、數(shù)據(jù)處理模塊和算法模塊,處理的數(shù)據(jù)文件格式為“.csv”或“.xls”。軟件的使用流程如圖3 所示,主要分為三步:①打開MSAP初始數(shù)據(jù)表格,啟動軟件,點(diǎn)擊左上角菜單“文件-打開”,在彈出的窗口中選擇一個或多個初始數(shù)據(jù)表格并打開;②點(diǎn)擊左上角菜單“分析-設(shè)置導(dǎo)出選項(xiàng)”,如圖所示,在彈出的新窗口中可以勾選需要統(tǒng)計的泳道(與96 孔板上樣孔一一對應(yīng)),點(diǎn)擊“確定”完成;③選擇導(dǎo)出方式并導(dǎo)出,點(diǎn)擊“分析-生成統(tǒng)計表”可對一個原數(shù)據(jù)文件進(jìn)行統(tǒng)計,點(diǎn)擊“分析-生成所有”則統(tǒng)計當(dāng)前打開的所有原數(shù)據(jù)文件。在生成統(tǒng)計表時,還可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本實(shí)際放置的位置,即對應(yīng)關(guān)系,選擇“橫向”或“縱向”生成統(tǒng)計表。我們應(yīng)用MSAP Analyst 模擬進(jìn)行了多種類似數(shù)據(jù)的處理,都獲得了理想的分析結(jié)果,因此以半?yún)^(qū)間放置法為基礎(chǔ)的MSAP Analyst 軟件可以應(yīng)用于DNA 甲基化的MSAP 熒光檢測初始數(shù)據(jù)的自動分析。另外,為了方便大家使用,我們設(shè)計了MSAP Analyst 軟件的在線分析網(wǎng)站(http://www.fly2leo.cn),支持軟件、測試數(shù)據(jù)和使用說明書的下載。

    表1 4種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法處理的結(jié)果

    圖3 MSAP Analyst數(shù)據(jù)處理軟件的操作界面

    3 討論

    人工分析法是直接將2 種酶切反應(yīng)的熒光圖譜進(jìn)行重合比較,根據(jù)熒光圖譜的差異確定甲基化類型,計算甲基化程度。數(shù)據(jù)處理過程中,可以及時地進(jìn)行人工調(diào)整,所以能夠最大程度地減少誤差,得到的分析結(jié)果最準(zhǔn)確,因而把這個結(jié)果定義為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果,把人工分析法定義為標(biāo)準(zhǔn)方法。而對于3 種自動轉(zhuǎn)換方法來說,由于堿基的最小值是1 bp,所以設(shè)置的區(qū)間跨度只能為1,因此3種分析方法都會出現(xiàn)2 個峰位置值在同一泳道位置(距離較短,近似重合)重復(fù)出現(xiàn)的情況,即重復(fù)位置值,重復(fù)位置值的出現(xiàn)會導(dǎo)致甲基化水平的計算誤差。直接取整法中,對峰位置值直接進(jìn)行簡單的四舍五入,忽略了初始數(shù)據(jù)的小數(shù)部分,產(chǎn)生了沒有進(jìn)行任何糾正的重復(fù)位置值,導(dǎo)致了較大的計算誤差。為了減小重復(fù)位置值的出現(xiàn),引入?yún)^(qū)間放置的概念。整區(qū)間放置法通過程序智能校正峰位置值,減少了部分重復(fù)位置值,所以甲基化程度的計算誤差比直接取整法小。根據(jù)人工分析法獲得的經(jīng)驗(yàn),對整區(qū)間放置法進(jìn)行了改進(jìn),得到半?yún)^(qū)間放置法。半?yún)^(qū)間放置法本身與樣品峰值圖吻合度最高,而且經(jīng)過程序智能校正,重復(fù)位置值進(jìn)一步減少,雖然不能完全消除重復(fù)位置值的產(chǎn)生,但可以保證甲基化程度的計算誤差最小。為了最大程度地減少重復(fù)位置值的出現(xiàn),我們設(shè)計的軟件中可以將每個泳道的重復(fù)值進(jìn)行標(biāo)識,使用人員可根據(jù)原始的峰位置圖進(jìn)行手動糾正這些重復(fù)位置值,以進(jìn)一步減小自動分析與標(biāo)準(zhǔn)分析之間的誤差。

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    [6]徐青,張沅,孫東曉,等.應(yīng)用MSAP 方法檢測雞不同組織基因組的甲基化狀態(tài)[J].遺傳,2011,33(6):620-626.

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