大腸桿菌菌蛻裝載質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

胡岸 ，吳婷，陳翀，檀英霞，張士坤，冷泠，李素波，高紅偉，季守平

1.中南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410012；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850

核酸疫苗是一種新型疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，其具有成本低廉、易于構(gòu)建和改造、導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞后可持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答等顯著優(yōu)勢(shì)，自1990 年被偶然發(fā)現(xiàn)以來(lái)發(fā)展迅速，成為當(dāng)前分子生物學(xué)和免疫學(xué)中新的研究熱點(diǎn)[1]。但核酸疫苗的免疫原性低下、誘發(fā)的免疫效果不佳，一直制約著其臨床應(yīng)用[2]。因此，核酸疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何提高核酸疫苗的免疫原性及其誘發(fā)的免疫反應(yīng)效果。研究者們使用各種方式以提高核酸疫苗對(duì)疾病的免疫保護(hù)能力，比如改變接種部位，使用脂多糖、分支桿菌等佐劑，結(jié)合電傳轉(zhuǎn)染技術(shù)等[3]，但增效作用都有限。鑒于抗原提呈細(xì)胞在核酸疫苗免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，因而提高核酸疫苗活性的根本途徑在于高效、特異地將核酸疫苗導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞，并使它得到高效表達(dá)[4]。這個(gè)過(guò)程中運(yùn)載核酸的載體非常關(guān)鍵，制備合適的DNA 導(dǎo)入載體成了研究者試圖提高核酸疫苗活性的重要策略。

近年來(lái)，菌蛻（bacterial ghosts，BG）被認(rèn)為是極具潛力的核酸疫苗載體[4]。菌蛻是將細(xì)菌細(xì)胞壁裂解、去除細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物之后形成的細(xì)菌空殼。菌蛻保留了較為完整的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和免疫原性，因而其表面結(jié)構(gòu)可以有效地與抗原提呈細(xì)胞相互作用，誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。同時(shí)，菌蛻可以裝載核酸疫苗，將其導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞中。當(dāng)裝載核酸疫苗的菌蛻進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，宿主的抗原提呈細(xì)胞就會(huì)主動(dòng)識(shí)別菌蛻，從而提高菌蛻裝載的核酸疫苗在抗原提呈細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)而增加抗原提呈及免疫應(yīng)答水平。菌蛻的發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用，為研究核酸疫苗載體提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)[5]。

在以往的研究中，我們初步建立了菌蛻的制備及裝載核酸疫苗的方法，發(fā)現(xiàn)菌蛻確有靶向運(yùn)載核酸疫苗的作用。但菌蛻裝載DNA 的效率不穩(wěn)定，且裝載質(zhì)粒DNA 后的菌蛻轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞的效率也有待提高[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們以大腸桿菌DH5α制備菌蛻，在文獻(xiàn)報(bào)道及前期工作基礎(chǔ)上，優(yōu)化菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的條件，以獲得更高且更穩(wěn)定的裝載效果。鑒于破碎大腸桿菌后的細(xì)胞膜（即膜囊）能影響裝載效率，其濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致裝載效率低下，我們摸索并優(yōu)化了菌蛻、質(zhì)粒和膜囊三者的最佳濃度比例。檢測(cè)裝載效率后，使用裝載質(zhì)粒DNA的菌蛻轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞RAW264.7（巨噬細(xì)胞系）和DC2.4（樹(shù)突狀細(xì)胞系），優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，進(jìn)一步分析菌蛻作為DNA 疫苗載體裝載質(zhì)粒DNA 并將其導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW264.7 巨噬細(xì)胞株和DC2.4 樹(shù)突狀細(xì)胞為本室保存；大腸桿菌DH5α購(gòu)于全式金公司；pHH43質(zhì)粒為德國(guó)Rainer Hass 教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒pDSred-N1購(gòu)于BD Clontech 公司；pVAXI-mIi-TM 為本室構(gòu)建；胎牛血清、胰酶、DMEM 培養(yǎng)基和1640 培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco 公司；PI 購(gòu)于Sigma 公司；HEPES 購(gòu)于Amresco 公司；Mito Tracker 購(gòu)于Invitrogen 公司；氯霉素、青霉素、鏈霉素購(gòu)于華北制藥有限公司；質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)于威格拉斯公司；DNA marker DL2000購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2 菌蛻的制備

轉(zhuǎn)化pHH43 質(zhì)粒至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在氯霉素抗性LB 固體培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑出單克隆菌落轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)，隨后以1∶100 擴(kuò)大培養(yǎng)，待D600nm為0.5 時(shí)于42℃誘導(dǎo)，當(dāng)D600nm值降到0.3 以下時(shí)離心收集菌體，加入50 mL 無(wú)菌水重懸，并加入200 U/μL 青霉素、鏈霉素各100μL，4℃靜置過(guò)夜，取上清離心，沉淀懸浮，4℃靜置過(guò)夜，小心取出上清，離心，棄除上清，用無(wú)菌水重懸沉淀，此時(shí)溶液均勻，無(wú)絮狀不溶物，再次離心，收集的沉淀即為菌蛻，用無(wú)菌PBS重懸，混勻，測(cè)定菌蛻濃度。

1.3 膜囊的制備

以1∶1000 將大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)入LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再以1∶100 將大腸桿菌轉(zhuǎn)入LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，棄上清，沉淀稱重，用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0，含20%蔗糖）重懸（每克菌體加入4 mL），每克菌體加入600μg 溶菌酶，依次加入0.1 mol/L EDTA、0.5 mol/L MgCl2，離心收集菌體，沉淀重懸于冰冷的10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，超聲波破碎，離心收集上清，40 000 r/min 離心1 h，沉淀重懸于2 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中。

1.4 菌蛻裝載質(zhì)粒

參照威格拉斯大提質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM，測(cè)定DNA 濃度。取質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi 質(zhì)粒各1 mg，加入400μL 冰冷的無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀溶于50μL HBS 中，測(cè)定質(zhì)粒DNA 的濃度；取菌蛻，6000 r/min 離心10 min，棄上清，用冰冷的CaCl2反復(fù)洗滌菌蛻（6000 r/min 離心10 min），棄上清，向菌蛻中加入10μL HBS，混勻；按菌蛻140μg/質(zhì)粒200μg 的比例向菌蛻中加入質(zhì)粒，加入HBS 定容至20μL，輕輕混勻，28℃水浴1 h；取出膜囊，按200μg 質(zhì)粒/80μg 膜囊的比例加入，加入13μL 0.1 mol/L CaCl2，輕輕混勻后于37℃過(guò)夜。

取出-20℃凍存的Mito Tracker染料，融后混勻，取0.5μL 稀釋至500μL PBS 中，混勻，取出37℃孵育的裝載混合液，每管加入35μL 染料，37℃靜置15 min，2000 r/min 離心10 min，加入PBS 定容至500μL，加入細(xì)胞核熒光染色劑PI 2μg/mL，混勻，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定裝載效率。

取制備的菌蛻和裝載質(zhì)粒pDSred-N1 的菌蛻，分別用掃描電鏡（HITACHI S-4500）和透射電鏡（Philps-EM 400T）觀察菌蛻的外膜結(jié)構(gòu)，以及菌蛻裝載質(zhì)粒前后的結(jié)構(gòu)變化。

1.5 抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻

37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7和樹(shù)突狀細(xì)胞DC2.4；取菌蛻裝載的質(zhì)粒pDSred-N1 1 mg（菌蛻用Mito Tracker 染色），與2 mL 無(wú)血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻，分別與RAW264.7細(xì)胞和DC2.4 細(xì)胞孵育過(guò)夜，用PBS 洗滌1 次，激光掃描共聚焦顯微鏡（Bio-Rad Radiance2100）觀察抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻的效果。按上述方法取1×106細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻的效率。

2 結(jié)果

2.1 菌蛻的制備

質(zhì)粒pHH43 為溫控型表達(dá)載體，可在42℃誘導(dǎo)表達(dá)φX174 噬菌體的裂解蛋白（E 蛋白），裂解革蘭陰性菌。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)過(guò)程中D600nm值明顯下降并維持在0.3 以下，提示大腸桿菌得到了有效裂解。將裂解細(xì)菌洗滌、離心，獲得菌蛻。將大腸桿菌在堿裂解液中超聲波破碎，獲得裂解的大腸桿菌。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，與大腸桿菌及其裂解液相比，菌蛻內(nèi)DNA已隨著細(xì)胞內(nèi)容物被洗去（圖1）。

2.2 菌蛻裝載質(zhì)粒的效率

本研究采用的裝載方法是在本研究室前期工作基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。分別用PI 將質(zhì)粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM 染色，菌蛻用Mito Tracker 標(biāo)記；將不同比例的質(zhì)粒DNA 與菌蛻混合孵育后，用膜囊將菌蛻封閉，以優(yōu)化裝載條件。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明，當(dāng)質(zhì)粒DNA、菌蛻、膜囊混合的比例為10∶7∶4 時(shí)裝載效率達(dá)到最高，2 種質(zhì)粒的裝載效率都達(dá)到了98%以上，其中片段較長(zhǎng)的質(zhì)粒pVAXImIi-TM 的裝載效率幾乎為100%。以上結(jié)果說(shuō)明菌蛻可以有效裝載質(zhì)粒DNA，且裝載效率不會(huì)受DNA片段大小的影響。

2.3 掃描電鏡和透射電鏡觀察菌蛻和裝載質(zhì)粒的菌蛻

為了檢測(cè)大腸桿菌是否得到了有效裂解，以及菌蛻是否能夠有效裝載質(zhì)粒DNA，我們將制備得到的菌蛻和裝載質(zhì)粒的菌蛻在掃描電鏡和透射電鏡下進(jìn)行觀察。掃描電鏡結(jié)果顯示（圖3A），在菌蛻的兩端出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，提示大腸桿菌被成功地誘導(dǎo)裂解，在菌體兩端形成了非常明顯的裂解通道。透射電鏡的結(jié)構(gòu)顯示，制備的菌蛻內(nèi)部基本不著色，提示其DNA 等內(nèi)容物基本洗滌干凈（圖3B）；反之，裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻內(nèi)部有有較多的高密度物質(zhì)（黑色絮狀物）（圖3C），提示菌蛻裝載質(zhì)粒DNA的效率較高，可以作為很好的質(zhì)粒DNA載體。

2.4 抗原提呈細(xì)胞吞噬菌蛻的效率

為了檢測(cè)菌蛻是否能有效導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞，增強(qiáng)質(zhì)粒DNA 的提呈效率，我們用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻（Mito Tracker 標(biāo)記）轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞RAW264.7和DC2.4，發(fā)現(xiàn)幾乎所有RAW264.3 細(xì)胞內(nèi)都可以觀察到綠色熒光信號(hào)，提示Mito Tracker 標(biāo)記的菌蛻被巨噬細(xì)胞吞噬到胞內(nèi)（圖4）。

圖1 大腸桿菌和菌蛻的DNA電泳圖

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定菌蛻裝載質(zhì)粒的效率

圖3 掃描電鏡和透射電鏡觀察裝載質(zhì)粒DNA前后的菌蛻

進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)定量分析轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果見(jiàn)圖5，RAW264.7和DC2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染菌蛻后，Mito Tracker 的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，將轉(zhuǎn)染前后的峰圖擬合，轉(zhuǎn)染后的峰明顯右移，且峰形較好，說(shuō)明基本上所有細(xì)胞均有吞噬現(xiàn)象，效率幾乎高達(dá)100%，從而顯示出標(biāo)記在菌蛻表面的綠色熒光。部分細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度較弱，提示其吞噬菌蛻的量較少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，菌蛻能夠高效導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞，這對(duì)增加DNA 疫苗在抗原提呈細(xì)胞中的表達(dá)水平是非常有益的。

3 討論

φX174噬菌體的裂解基因E編碼一個(gè)含91個(gè)氨基酸殘基的膜蛋白，該蛋白能夠融合革蘭陰性菌的內(nèi)外膜，并在菌膜上形成一個(gè)直徑為40～200 nm 的特異性跨膜孔道?？缒た椎赖男纬墒沟酶锾m陰性菌內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)容物由裂解孔道排出，生成菌蛻。采用這種方法已成功地制備了大腸桿菌、霍亂弧菌和幽門(mén)螺桿菌等的細(xì)菌菌蛻[7-8]。在菌蛻制備過(guò)程中，細(xì)菌表面的抗原結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到任何化學(xué)和物理作用的損傷，保留了活菌樣的完好形態(tài)結(jié)構(gòu)，如脂多糖、肽聚糖和包膜特異性受體等免疫刺激成分，因而能夠被巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞主動(dòng)攝取，具有免疫系統(tǒng)靶向性質(zhì)[9]。故而裝載核酸的菌蛻能夠靶向性地將DNA 導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞，是良好的DNA 疫苗遞送載體。菌蛻可經(jīng)口服、皮下、肌肉注射等途徑使用，可操作性極強(qiáng)[10]。此外，作為細(xì)菌空殼，菌蛻沒(méi)有感染能力，具有安全性好，易于制備、保存等優(yōu)點(diǎn)，有望成為安全有效的核酸疫苗遞送載體，被廣泛開(kāi)發(fā)用于各個(gè)領(lǐng)域，如腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)和發(fā)展、靶標(biāo)藥物和微酶反應(yīng)等[11]。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記菌蛻被巨噬細(xì)胞RAW264.3吞噬

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗原提呈細(xì)胞

高效地將質(zhì)粒DNA 裝載到菌蛻中，是菌蛻介導(dǎo)的核酸疫苗遞送能否成功的關(guān)鍵步驟。Pauker等發(fā)現(xiàn)每個(gè)菌蛻可以裝載6000 個(gè)質(zhì)粒DNA，容量很大，且裝載質(zhì)粒的菌蛻能靶向到小鼠巨噬細(xì)胞，表達(dá)率為60%[12]。但我們參照他們的方法裝載質(zhì)粒DNA 卻一直沒(méi)有成功。究其原因，Pauker 等直接將DNA 與菌蛻混合，以包被質(zhì)粒，但他們提供的實(shí)驗(yàn)方法中缺少將裝載的DNA 封閉在菌蛻中的關(guān)鍵步驟，導(dǎo)致裝載在菌蛻中的DNA 在洗滌過(guò)程中丟失。在前期研究中，我們用大腸桿菌菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 之后，用大腸桿菌膜囊封閉菌蛻，成功地將質(zhì)粒DNA 裝載在菌蛻內(nèi)[13]，使用裝載質(zhì)粒DNA 的菌蛻轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞Raw264.7，報(bào)告基因的表達(dá)效率可超過(guò)50%。但前期研究的裝載效率偏低，且不穩(wěn)定，原因可能是只對(duì)菌蛻和質(zhì)粒的濃度比例進(jìn)行了探索，沒(méi)有優(yōu)化膜囊濃度。在本研究中，我們將大腸桿菌DH5α超聲波破碎后，離心收集破碎的細(xì)胞膜成分，即膜囊。我們發(fā)現(xiàn)膜囊能影響菌蛻裝載效率。膜囊濃度過(guò)低，裝載質(zhì)粒的菌蛻不能完全封閉；膜囊濃度過(guò)高，會(huì)影響菌蛻裝載質(zhì)粒效率。我們對(duì)菌蛻、質(zhì)粒和膜囊三者的最佳濃度進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，彌補(bǔ)了之前研究的空缺。結(jié)果表明，質(zhì)粒、菌蛻、膜囊三者的濃度比為10∶7∶4 時(shí)可達(dá)到最高裝載效率，效率穩(wěn)定維持在98%以上，多數(shù)情況可高達(dá)100%。

為了測(cè)定菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的效率，我們按照之前的方法將DNA 用PI 染色，菌蛻包被質(zhì)粒，隨后菌蛻用Mito Tracker 標(biāo)記，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)裝載。然而在檢測(cè)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)PI 染色效果不好，同樣裝載方法的所獲得產(chǎn)物的檢測(cè)值波動(dòng)較大。這可能是由于用PI 染色后，菌蛻包被過(guò)夜處理、Mito Tracker 標(biāo)記菌蛻等步驟對(duì)熒光染料PI 產(chǎn)生了不利影響。于是我們嘗試菌蛻包被質(zhì)粒后，用Mito Tracker 標(biāo)記菌蛻，再用PI 將質(zhì)粒染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。這樣改進(jìn)后，PI 濃度僅為2μg/mL 即可成功染色，而且染色效果比改進(jìn)前要好。PI 對(duì)質(zhì)粒DNA 的染色效果非常穩(wěn)定，同種裝載條件所獲得的檢測(cè)結(jié)果也非常穩(wěn)定。

最后，我們優(yōu)化了菌蛻介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染程序，發(fā)現(xiàn)裝載DNA 的菌蛻濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響很大。當(dāng)菌蛻濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，可獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，幾乎所有細(xì)胞內(nèi)部均可看見(jiàn)綠色熒光，提示RAW264.7 及DC 等抗原提呈細(xì)胞能夠高效吞噬菌蛻。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示2種細(xì)胞對(duì)菌蛻的吞噬效率均為100%。

綜上所述，我們成功地制備了菌蛻，優(yōu)化了菌蛻裝載質(zhì)粒DNA 的條件，建立了穩(wěn)定的裝載方法及裝載效率的檢測(cè)方法，提高了菌蛻裝載DNA 的裝載效率，使菌蛻裝載幾乎達(dá)到100%。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，幾乎在100%的抗原提呈細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到菌蛻，提示菌蛻確實(shí)是一種靶向有潛力的高效遞送載體，能高效進(jìn)入巨噬細(xì)胞并使攜帶的質(zhì)粒DNA 獲得高水平表達(dá)。今后我們將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討菌蛻提高DNA 疫苗免疫應(yīng)答水平的可能性。我們相信，隨著對(duì)免疫科學(xué)進(jìn)一步的探索，菌蛻高效運(yùn)載核酸的潛力將進(jìn)一步被挖掘，成為治療疾病的強(qiáng)有力工具。

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