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    TPP1基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建及鑒定

    2014-11-29 04:16:22張金丁金蕊楊丹丹王亞楠黃君健蘇金為
    生物技術(shù)通訊 2014年6期
    關(guān)鍵詞:端粒復(fù)合體外源

    張金丁,金蕊,楊丹丹,王亞楠,黃君健,蘇金為

    1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100850;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866

    端粒是真核生物細(xì)胞染色體末端的天然保護(hù)結(jié)構(gòu),由DNA重復(fù)序列TTAGGG和結(jié)合在端粒DNA序列上的端粒蛋白復(fù)合體組成,對穩(wěn)定基因組起到至關(guān)重要的作用[1]。端粒蛋白復(fù)合體(在哺乳類動物中被稱為shelterin)由6 個獨(dú)立的蛋白組成,分別是TRF1(端粒重復(fù)結(jié)合因子1)、TRF2、RAP1(阻抑蛋白/激活蛋白1)、TIN2(TRF1 相互作用蛋白1)、TPP1(TINT1[2]/PIP1[3]/PTOP1[4])和Pot1(端粒保護(hù)蛋白1)。其中TRF1和TRF2 結(jié)合在雙鏈DNA 的端粒重復(fù)序列上,而Pot1 結(jié)合在單鏈懸突上,這些端粒DNA 結(jié)合蛋白通過TPP1和TIN2 的相互作用連接起來,在染色體末端保護(hù)和端粒長度調(diào)控中至關(guān)重要[5]。

    有關(guān)TPP1 的研究表明,在腫瘤細(xì)胞中,TPP1 與Pot1的相互作用具有將Pot1帶入細(xì)胞核并端粒定位的功能,并在端粒末端負(fù)責(zé)聚集端粒酶,維持端粒長度的穩(wěn)態(tài)。也有相關(guān)研究表明,TPP1和TIN2 是調(diào)控裝配該蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵元件,TRF1和TRF2 亞復(fù)合體的連接也需要TPP1和TIN2 的作用[6]。TPP1有助于穩(wěn)定TRF1-TIN2-TRF2 之間的相互作用,并促進(jìn)6個蛋白復(fù)合體的形成。TPP1高表達(dá)可以加強(qiáng)TIN2-TRF2 的結(jié)合,敲低TPP1 后會降低內(nèi)源TRF1與TRF2復(fù)合體結(jié)合的能力,并且蛋白復(fù)合體的形成也會受到嚴(yán)重影響[5]。我們利用質(zhì)粒載體pll3.7構(gòu)建了抑制人TPP1基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾載體,用于抑制端粒結(jié)合蛋白TPP1 的表達(dá),為后期進(jìn)一步研究TPP1的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    細(xì)胞株293T、HT1080、HepG2,大腸桿菌DH5α,質(zhì)粒pll3.7(圖1),慢病毒包裝載體RRE、REV、VSVG由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pCDH-Flag-Pot1、pCDHFlag-TPP1 為本課題組構(gòu)建;質(zhì)粒提取試劑盒購自Exygen公司;膠回收試劑盒購自北京天根生物公司;限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ,T4DNA 連接酶均購自NEB 公司;Flag 抗體和GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗均購自Sigma 公司;Western 印跡顯色試劑盒購自Thermo 公司;核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

    1.2 靶向TPP1的shRNA設(shè)計

    根據(jù)shRNA設(shè)計原則[5],參考GenBank公布的人TPP1序列(NM_000391.3),利用Invitrogen 公司在線設(shè)計軟件設(shè)計shRNA 序列(表1),進(jìn)行BLAST 同源性分析,保證序列的惟一性。為方便克隆,在其5′端和3′端分別引入HpaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(為方便后期酶切鑒定,設(shè)計序列時將酶切位點(diǎn)的最后一個堿基削掉),反義鏈的3′端接終止信號TTTTTT,以終止轉(zhuǎn)錄。序列由英駿公司合成。

    1.3 TPP1干擾載體的構(gòu)建

    將合成的寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA(95℃5 min,72℃10 min,自然降至室溫),同時將shRNA載體pll3.7 用HpaⅠ/XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后,把退火形成的產(chǎn)物DNA 雙鏈與酶切回收的線性化載體片段于20℃連接4 h,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將其涂布在含氨芐西林的LB 平板上,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,每個平板挑4 個菌落進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,提質(zhì)粒,用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切鑒定,將已插入shRNA片段的載體送北京博邁德公司測序。

    1.4 慢病毒的包裝與感染

    將293T 細(xì)胞接到10 cm 皿中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時,將慢病毒包裝載體RRE∶REV∶VSVG 與干擾質(zhì)粒按照4.2∶2.1∶3.1∶4μg 混合,加入氯化鈉注射用水500μL 混勻,40μL 轉(zhuǎn)染試劑PEI 中同樣加入氯化鈉注射用水500μL 混勻,然后將兩者混合均勻,靜置15 min,加入293T 細(xì)胞中,72 h 后收上清,用0.45μm的濾膜過濾,得到的上清液即為包裝好的病毒,用于感染事先準(zhǔn)備好的穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-TPP1 的HT1080 細(xì)胞,其余的病毒分裝于EP 管中,-80℃凍存,用于反復(fù)感染細(xì)胞,直到感染效率達(dá)90%以上。

    圖1 質(zhì)粒載體pll3.7的結(jié)構(gòu)圖譜

    表1 根據(jù)人的TPP1基因設(shè)計的2對shRNA序列

    1.5 TPP1的shRNA干擾效果檢測

    1.5.1 檢測TPP1的shRNA的干擾效果[7]將穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-TPP1 的HT1080 細(xì)胞鋪到6 孔板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞密度為60%~80%時進(jìn)行病毒感染,次日換液并再次感染,在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。在慢病毒表達(dá)24和96 h后收取50%的細(xì)胞量,按如下程序進(jìn)行Western印跡檢測。

    根據(jù)樣品蛋白分子量大小選擇合適濃度的SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳分離,電泳結(jié)束后將目的膠取下,用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上,注意濾紙、膠和膜要剪成大小一致,防止短路,上層濾紙切勿接觸到下層濾紙,轉(zhuǎn)膜電壓和時間按照目的蛋白大小進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整;用5%脫脂奶粉(用1×TBST 配制)于室溫下?lián)u床封閉1 h 左右;加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的一抗,室溫輕搖1 h 或于4℃冰箱中過夜,1×TBST 洗膜3 次,每次5 min;加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的二抗,室溫輕搖1 h,1×TBST 洗膜3 次,每次5 min;按Thermo 公司的Western 印跡顯色試劑盒說明書進(jìn)行顯色2~3 min,壓片顯影。

    1.5.2 檢測穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1 的端粒定位 將穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1 的HepG2 細(xì)胞鋪到6 孔板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞密度為60%~80%時進(jìn)行感染病毒,次日換液并再次感染,在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。在熒光蛋白表達(dá)量達(dá)到80%以上時消化細(xì)胞,鋪12孔板,按如下程序進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)[8]。

    將消化好的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM混勻后,接種到事先加入蓋玻片的12 孔板中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24 h 后觀察細(xì)胞密度,達(dá)到70%~80%后取出12 孔板,棄DMEM 培養(yǎng)液,用1×PBS 洗1 次;每孔加入500μL 4%多聚甲醛,室溫固定10 min,棄固定液;每孔加入500μL 封閉液,室溫?fù)u床上振蕩30 min,棄封閉液,1×PBS 洗3 次,每次5 min;按抗體說明書的要求,用1×PBS 稀釋一抗,每片蓋玻片孵25~30μL 稀釋抗體,于37℃恒溫孵育箱中結(jié)合1 h 或在4℃冰箱中過夜,在避光條件下用1×PBS 洗膜3 次,每次5 min;用1×PBS 按照一定比例稀釋DAPI,每孔加入500μL 染核液,避光染核5~10 min,熒光顯微鏡下觀察染色情況。

    2 結(jié)果

    2.1 TPP1的shRNA序列設(shè)計

    根據(jù)人的TPP1序列設(shè)計4 條shRNA 序列(表1),經(jīng)BLAST 分析人基因數(shù)據(jù)庫序列,TPP1-si1和TPP1-si2 未發(fā)現(xiàn)同源序列,說明設(shè)計的序列特異性良好。

    2.2 TPP1 shRNA干擾載體的鑒定

    按前述構(gòu)建方法構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shTPPl 質(zhì)粒,分別命名為pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2。pll3.7 空載體上有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(第4431 位堿基),同時用EcoRⅠ和HpaⅠ(第2935 位堿基)進(jìn)行酶切時,可以切下1500 bp 左右的片段,而所構(gòu)建的干擾質(zhì)粒在設(shè)置酶切位點(diǎn)時被削掉一個堿基,載體與片段連接后無法再被識別,使得pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2 質(zhì)粒不能被HpaⅠ識別,而只被EcoRⅠ識別,單酶切成線性DNA。鑒定結(jié)果如圖2,表明外源片段shRNA 序列TPP1-si1和TPP1-si2 已插入pll3.7 載體。將測序結(jié)果與原設(shè)計的序列用DNAMAN 軟件進(jìn)行比對,匹配率為100%,表明正確插入了外源片段序列。

    2.3 pll-shRNA抑制TPP1蛋白表達(dá)的效果檢測

    用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒及空載體pll3.7 進(jìn)行慢病毒的制備,轉(zhuǎn)染效率如圖3 所示。將制備的慢病毒pll3.7、pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2 感染高表達(dá)外源性TPP1 蛋白的HT1080 細(xì)胞,分別在表達(dá)后24和96 h 收細(xì)胞進(jìn)行Western 印跡,結(jié)果用PhotoShop 7.0 軟件分析(圖4),設(shè)計的2 條shRNA 對TPP1 都有不同程度的抑制效果,且抑制效果隨感染時間的延長而增強(qiáng),24 h的抑制效果分別為34.88%、30.59%,96 h 的抑制效果分別為70.56%、67.71%,其中pll-TPP1-si1對TPP1蛋白表達(dá)的抑制效果最好。

    圖2 干擾質(zhì)粒雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

    圖3 空載體pll(A)和shRNA序列(B)對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

    2.4 shRNA 敲低TPP1 蛋白表達(dá)水平后,檢測穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Pot1的端粒定位

    圖4 Western印跡檢測pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2病毒對高表達(dá)外源TPP1的HT1080細(xì)胞的抑制效果

    圖5 熒光觀察空載體pll和pll-TPP1-si1病毒對HepG2細(xì)胞的感染效率

    選取抑制效果好的pll-TPP1-si1 病毒,以空載體pll 慢病毒為對照,感染穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1的HepG2細(xì)胞,多次感染直到感染效率達(dá)80%~90%時(圖5)將細(xì)胞鋪到12 孔板中,24 h 后進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn),結(jié)果如圖6。相關(guān)研究報道端粒蛋白Pot1 進(jìn)入細(xì)胞核及端粒定位需要TPP1 的介導(dǎo)[9]。感染空載體pll和pll-TPP1-si1慢病毒的試驗(yàn)組HepG2細(xì)胞在綠色熒光下呈現(xiàn)綠色熒光。Pot1由于內(nèi)源性TPP1 受到抑制,使得Pot1 能入核,但無法端粒定位,在紅色熒光下觀察不到端粒的點(diǎn)狀聚集;而對照組由于不帶有TPP1shRNA 干擾序列,不能抑制內(nèi)源TPP1 的表達(dá)水平,從而不影響Pot1 進(jìn)入細(xì)胞核并端粒定位,在紅色熒光下觀察到有紅色點(diǎn)狀聚集。以上免疫熒光分析表明構(gòu)建的pll-TPP1-si1 干擾質(zhì)粒能有效抑制內(nèi)源性TPP1的表達(dá)。

    3 討論

    腫瘤細(xì)胞中的端粒及端粒結(jié)合蛋白一直是研究熱點(diǎn)之一。有研究報道,端粒在確?;蚪M的穩(wěn)定性和完整性上至關(guān)重要[10],端粒內(nèi)穩(wěn)態(tài)在癌癥治療,尤其是放射治療方面具有很好的潛能[11]。哺乳動物細(xì)胞通過端粒特有的蛋白可以區(qū)分正常染色體末端,使其不被識別為損傷的DNA 而誘發(fā)ATM(ataxia-telangiectasia mutated)或ATR(ataxia-telangieetasia and Rad3 related)介導(dǎo)的DNA 損傷反應(yīng),出現(xiàn)DNA 損傷蛋白53BPl和γ-H2AX 在端粒的聚集,導(dǎo)致細(xì)胞增殖衰竭或凋亡[12]。

    端粒蛋白TPP1 在Pot1 功能調(diào)控上具有多層次意義,涉及Pot1入核、入核后的端粒定位及Pot1到達(dá)端粒后最終發(fā)揮功能等多個過程步驟[5]。Pot1 蛋白在端粒上具有重要的功能,能夠保護(hù)和決定染色體DNA的5′端序列[13]。RNA干擾敲低Pot1后會導(dǎo)致端粒延長,出現(xiàn)染色體的不穩(wěn)定性[14],TPP1敲低后也會出現(xiàn)類似現(xiàn)象,并抑制Pot1 募集到端粒[15]。Pot1 與TPP1 相互作用能夠調(diào)控端粒酶到達(dá)染色體末端,并且保護(hù)端粒免受DNA 損傷[4]。而且,也有體外試驗(yàn)表明Pot1 與TPP1 相互作用能增強(qiáng)端粒酶的合成能力[16]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在分裂增殖過程中保持穩(wěn)定的端粒長度,進(jìn)行持續(xù)分裂[17]。因而,在腫瘤細(xì)胞中通過敲低端粒蛋白來誘導(dǎo)其端粒功能障礙有可能成為一種新的治療方案。

    圖6 免疫熒光觀察穩(wěn)定表達(dá)Flag-Pot1的HepG2細(xì)胞感染pll和pll-TPP1-si1病毒

    我們采用shRNA 設(shè)計原則構(gòu)建出2 個抑制TPP1基因的shRNA 干擾載體,Western 印跡初步鑒定能夠有效抑制TPP1蛋白的表達(dá),并且在穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1 的HepG2 細(xì)胞中進(jìn)行了功能驗(yàn)證,免疫熒光結(jié)果表明感染pll-TPP1-si1 病毒的細(xì)胞由于內(nèi)源TPP1蛋白受到抑制,從而導(dǎo)致其介導(dǎo)的Pot1 不再端粒定位??傊?,本試驗(yàn)為后期探討TPP1的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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