PIMT對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響①

張 慧 宗 明 李 牛 虞珊珊 孫立山 范列英

(上海市東方醫(yī)院同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海 200120)

前期研究發(fā)現(xiàn)蛋白異天冬氨酰甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein isoaspartyl-methyltransferase，PIMT)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)滑膜成纖維樣細胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)中表達下降［1］，而PIMT是與細胞增殖、凋亡相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶［2，3］。本研究通過將 PIMT 表達載體轉(zhuǎn)染 RAFLS，在RA-FLS細胞中的過表達PIMT，探討PIMT對于RA-FLS細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 原代RA-FLS(本室保存)

1.1.2 載體 pcDNA3.1(－)B-flag(本室保存)。

1.1.3 引物設(shè)計與合成

1.1.3.1 PIMT表達質(zhì)粒引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中PIMT基因mRNA序列設(shè)計擴增引物，primer1:5'-TAACTCGAGACCATGCCGGGAGCGCGCAGT-3'，primer2:5'-TAAGGATCCCTTCAACCTGGACCACTGCTTTTCTTTATCTG-3'，于引物的 5'端加上BamHⅠ和XholⅠ限制性內(nèi)切酶位點和保護堿基，擴增片段長度855 bp，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.1.3.2 PIMT半定量熒光PCR引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中PIMT基因mRNA序列設(shè)計擴增引物，primer1:5'-TGGGAAAACTGCTGGGCACCG-3'，primer2:5'-GGTTTCCGCCTGCAGGACCAA-3'。管家基因 GAPD H引物為primer1:5'-TGACTTCAACAGCGA-3'，primer2:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';引物由上海Invitrogen公司合成。

1.1.4 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(美國 Gibco公司)，25 cm2培養(yǎng)瓶，6孔板，10 cm2培養(yǎng)皿(美國Corning公司)，總RNA抽提試劑Trizol(美國Invitrogen公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Invitrogen公司)，SYBR Green PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)，抗flag單克隆抗體(美國Sigma公司)，羊抗鼠HRP抗體(Abcam公司)，Annexin VFITC流式檢測凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.1.5 主要實驗儀器 水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)，ABI 7300熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司)，Kubota 3500臺式高速低溫離心機(日本Kubota公司)，天能(Tanon)凝膠成像系統(tǒng)(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，流式分析儀(BD)，CO2培養(yǎng)箱(FORMA)，倒置式系統(tǒng)顯微鏡(OLYMPUS)，超凈臺(BAKER)，電熱恒溫水浴箱。

1.2 方法

1.2.1 RA-FLS細胞的原代培養(yǎng) 關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中取出的滑膜組織用無菌手術(shù)剪剪成1 mm3大小，以5 mm的間距均勻排列于25 cm2培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，以濕潤組織為宜，將培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面向上置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5 h后將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d更換培養(yǎng)液一次，待FLS成片生長時，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。待RA-FLS長至70%～80%時進行細胞傳代。本研究中所用RA-FLS為3～5代細胞。

1.2.2 PIMT表達質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.2.1 外周血單個核細胞(PBMC)分離 抽取健康體檢者靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，用淋巴細胞分離液分離PBMC，加Trizol 1 ml，－20℃保存，用于RNA制備。

1.2.2.2 抽提總RNA 將上述標(biāo)本按Trizol操作說明書提取總RNA，終體積30 μl。0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量有無降解。紫外分光光度儀測定260/280 nm吸光值(OD)，確定RNA的含量和純度。

1.2.2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 在薄壁管中配制反應(yīng)溶液: 總 RNA 2 μg，oligo primer(50 μmol/L)1 μl，dNTP mix(10 μmol/L)1μl，加入經(jīng) DEPC 處理的ddH2O 至總體積 10 μl，65℃ 預(yù)變性 5 min。繼續(xù)配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系:10×RT buffer 2 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，DTT(0.1 mol/L)2 μl ，RNAase OUT(40 U/μl)1 μl，SuperScrip Ⅲ RT(200 U/μl)1 μl，至總體積 20 μl。50℃保溫 50 min 后，85℃變性5 min終止反應(yīng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.4 PCR擴增目的片段 反應(yīng)體系共50 μl，5 × PS buffer 10μl，dNTP Mix 4 μl，Primer Mix(20 μmol/L)1 μl，cDNA 4 μl，Primer Star 0.5 μl，加ddH2O 至50 μl體積。擴增條件:98℃ 10 s，68℃ 1 min，共42個循環(huán)。

1.2.2.5 PIMT陽性克隆的制備 PCR產(chǎn)物的純化按說明書操作;純化產(chǎn)物與pcDNA3.1(-)B-flaghrGFP載體進行連接，操作按說明書。常規(guī)制備感受態(tài)大腸桿菌Top10;連接產(chǎn)物全量(10 μl)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10;PCR篩選鑒定陽性克隆，得到PIMT片段的克隆質(zhì)粒 pcDNA3.1(－)B-flag-PIMT。質(zhì)粒送上海邁普生物公司測序，最終證實PIMT的cDNA片段序列的正確性。抽提、純化重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(－)B-flag-hrGFP-PIMT，PCR 擴增檢測質(zhì)粒。

1.2.3 PIMT表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RA-FLS 轉(zhuǎn)染前一天種2×106個細胞于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將2 μg質(zhì)粒 DNA溶于500 μl Opti-Mem無血清培養(yǎng)基中;將5 μl lipo2000溶于500 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，混勻室溫放置5 min。將上述兩管溶液混合，放置30 min后加入6孔板對應(yīng)孔中，4～6 h時換成含有血清的1640培養(yǎng)基。

1.2.4 PIMT mRNA在RA-FLS細胞中的表達 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，抽提細胞 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR檢測PIMT mRNA表達水平。定量PCR反應(yīng)體系如下:2 μl cDNA，引物1和引物 2 各 0.5 μl(20 μmol/L)，ddH2O 9 μl，0.5 μl ROX，2 ×SYBR Premix EX Taq 12.5 μl，混勻后置熒光定量PCR儀進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s，再進行40個循環(huán):95℃ 5 s，60℃ 31 s，最后延伸1個循環(huán):60℃ 1 min，95℃ 15 s。循環(huán)結(jié)束后進行熔解曲線測定。基因表達相對水平計算:PIMT基因相對于管家基因GAPDH的表達水平根據(jù) 2－ΔCt計算，ΔCt=Ct(待測基因)－Ct(GAPDH)，各樣品間的模板量平衡采用與上述標(biāo)準(zhǔn)參考樣品間ΔCt值進行校正，RA-FLS細胞中PIMT基因相對于管家基因GAPDH的表達水平最終用2－ΔCt計算公式進行轉(zhuǎn)換，重復(fù)該實驗三次。

1.2.5 PIMT蛋白在RA-FLS細胞中的表達 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白并定量，Western blot檢測PIMT蛋白表達水平:SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜50 min，室溫封閉2 h，加一抗antiflag(1∶10 000)4℃過夜，用PBST洗滌三次后加二抗(1∶5 000)室溫反應(yīng)30 min，PBST洗滌三次后掃描。

1.2.6 PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響 用4℃預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，用250 μl結(jié)合緩沖液重懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×105ml－1。取100 μl的細胞懸液于 5 ml流式管中，加入 5 μl的 Annexin V/FITC 和 10 μl 20 μg/ml的碘化丙錠溶液。混勻后于室溫避光孵育15 min。在反應(yīng)管中加入400 μl的PBS，流式細胞儀(FITC)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析;配對數(shù)據(jù)采用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PIMT表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物連接至pcDNA3.1(－)B-flag-hrGFP載體上后，轉(zhuǎn)化大腸肝菌Top10得到重組質(zhì)粒，PCR法和雙酶切鑒定陽性克隆，同時該陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)邁普公司測序鑒定，證明序列與Genebank的序列基本一致，但在565 bp處 C→T，經(jīng) BLAST比對，此處為 SNP位點(rs17355457)，見圖1。

2.2 PIMT表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，半定量熒光PCR檢測RA-FLS細胞mRNA變化情況。正常對照中PIMT mRNA相對于GAPDH的表達水平是0.202拷貝/ml，轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照是0.273拷貝/ml，而轉(zhuǎn)染了 pcDNA3.1-PIMT載體的RA-FLS細胞中PIMT mRNA相對于GAPDH的表達水平則是2.657拷貝/ml，與正常對照和陰性對照相比，有約13倍的升高，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.287，P ＜0.01，圖2)。Western blot檢測 PIMT 蛋白變化水平，用抗flag抗體檢測PIMT在RA-FLS中的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-PIMT載體的RA-FLS細胞能檢測到抗flag抗體的表達，而空白對照和陰性對照中不能檢測到抗flag抗體的表達(圖3)。

2.3 PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響 于轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡變化情況，與正常對照相比較，轉(zhuǎn)染了PIMT表達載體的細胞凋亡水平升高由5.11%上升至12.74%;與轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照相比較，轉(zhuǎn)染表達載體的RA-FLS細胞凋亡水平由12.74%上升至22.59%(圖4)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.448，P＜0.01)。

圖1 PIMT表達質(zhì)粒測序結(jié)果(正向，反向)Fig.1 PIMT expression plasmid sequencing results(Forward，Reverse)

圖2 轉(zhuǎn)染PIMT表達載體后，RA-FLS細胞PIMT mRNA變化(P＜0.01)Fig.2 Expression level of mRNA of PIMT changed(P ＜0.01)

圖3 轉(zhuǎn)染PIMT表達載體后，Western blot檢測抗flag抗體Fig.3 Western blot analysis for anti-flag after transfected vector of PIMT into RA-FLS

圖4 轉(zhuǎn)染PIMT表達載體后，RA-FLS細胞凋亡的變化(P＜0.01)Fig.4 Apoptosis level of RA-FLS changed after 48 h transfected with expressed plasmid(P＜0.01)

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的自身免疫病，我國發(fā)病率約為0.3%～0.5%，是造成人群勞動力喪失和致殘的主要疾病之一。RA的基本病理改變是持久反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)滑膜慢性增生性非化膿性炎癥，侵入滑膜下軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［4］。近年來的研究證明RA-FLS的增殖與凋亡失調(diào)是關(guān)節(jié)滑膜炎性增生，關(guān)節(jié)破化的主要原因之一［5，6］。因此，尋找與 FLS 增殖/凋亡失調(diào)相關(guān)的蛋白質(zhì)，并闡明該蛋白質(zhì)在FLS增殖與凋亡失調(diào)中的具體調(diào)節(jié)機制，對研究RA發(fā)病機制和尋找治療靶點具有重要意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PIMT在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細胞中(RA-FLS)中表達下降，而PIMT是一個與細胞增殖、凋亡相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶，因此，本研究通過在RA-FLS細胞中過表達PIMT，探討PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響。

生理條件下，蛋白質(zhì)中的L-天冬酰胺酰殘基(L-asparaginyl residues)和L-天冬氨酰殘基(L-aspartyl residues)會自發(fā)的脫氨?；虍悩?gòu)化形成異常的L-天 冬 氨 酰(abnormall-isoaspartylresidues，L-isoAsp)，這種異常的L-isoAsp在蛋白內(nèi)集聚能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并影響蛋白質(zhì)功能［7，8］。PIMT是普遍存在于原核細胞與真核細胞中的修復(fù)酶，在生理條件下能識別并轉(zhuǎn)移S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，AdoMet)中甲基基團至異常的L-天冬氨酰(L-isoaspartyl)殘基中的游離羧基上，修復(fù)異常的L-天冬氨酰殘基轉(zhuǎn)變成正常的L-天冬氨酰，并恢復(fù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。研究顯示，與正常的小鼠相比較，敲除PIMT基因的小鼠其CD4+T淋巴細胞和脾細胞過度增殖，而將這種小鼠的骨髓移植給正常小鼠，會產(chǎn)生抗DNA抗體和表現(xiàn)典型紅斑狼瘡腎炎的病理變化［9］。而在腫瘤細胞中PIMT基因的缺失也能引起細胞增殖。在小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞和COS-1細胞系中，PIMT基因缺失會導(dǎo)致細胞抵御Bax誘導(dǎo)的凋亡［10］。

本研究通過構(gòu)建PIMT表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染RAFLS細胞，發(fā)現(xiàn)PIMT表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RA-FLS細胞后，PIMT在mRNA水平和蛋白水平均明顯升高，表明PIMT表達載體轉(zhuǎn)染 RA-FLS細胞成功;轉(zhuǎn)染PIMT表達載體的RA-FLS細胞的凋亡水平明顯高于陰性對照RA-FLS細胞，表明PIMT升高會引起RA-FLS細胞凋亡上升，因此PIMT在RA-FLS細胞中表達下降是RA-FLS細胞凋亡減少的重要原因之一，PIMT對RA-FLS細胞增殖/凋亡失調(diào)中有一定的調(diào)節(jié)作用。

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