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    橋本甲狀腺炎患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體與人類白細(xì)胞抗原基因?qū)︻l率的分析①

    2014-11-27 10:25:48李建婷侯巖峰焦玉蓮趙躍然曹銘鋒趙家軍張海清李明龍山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科濟(jì)南250021
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2014年1期
    關(guān)鍵詞:抑制性配體活化

    李建婷 郭 成 侯巖峰 焦玉蓮 趙躍然 孫 慧 徐 進(jìn) 曹銘鋒 高 聆 趙家軍 張海清 李明龍(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科,濟(jì)南250021)

    殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)主要表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞(Natural killer,NK)和部分T細(xì)胞表面,通過特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA),調(diào)控NK細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫活性。HLA-C屬于經(jīng)典的HLA-I類分子,廣泛分布于有核細(xì)胞表面,根據(jù)第80位氨基酸的不同,可將HLA-C分為HLA-C1(Asn80)和HLA-C2(Lys80)兩組。HLA-C1組包括 HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08,特異性識(shí)別 KIR2DL2/3和 KIR2DS2;HLA-C2 組包括 HLA-Cw02、Cw04、Cw05、Cw06,特異性識(shí)別KIR2DL1和KIR2DS1。兩組HLA-C配體分別與不同的KIR受體結(jié)合,影響機(jī)體自身的免疫穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1-3]。

    橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT)是自身免疫甲狀腺病的一種,其發(fā)病機(jī)制可能與HT患者體內(nèi)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫功能紊亂有關(guān),但是具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在以往研究的基礎(chǔ)上,用序列特異性引物PCR(sequence specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP)方法進(jìn)一步分析KIR/HLA受體配體基因?qū)Φ姆植技捌渑cHT發(fā)病間的關(guān)聯(lián)性。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與引物 Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司,dNTP購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4,5],由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.2 研究對(duì)象的選擇 HT組選擇2012年10月至2013年3月就診于山東省立醫(yī)院的山東地區(qū)橋本甲狀腺炎患者44例,其中男1例,女43例,患者全部存在彌漫性甲狀腺腫大,實(shí)驗(yàn)室檢查見甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)明顯升高,甲狀腺B超示符合橋本甲狀腺炎表現(xiàn),甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果確診為HT,并排除其他甲狀腺及自身免疫性疾病。對(duì)照組為同期同地區(qū)無血緣關(guān)系的隨機(jī)健康個(gè)體43例,其中男1例,女42例,均排除甲狀腺疾病、自身免疫性疾病及相關(guān)家族病病史。HT患者組與對(duì)照組的年齡、性別分布經(jīng)檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    1.3 基因組DNA提取 空腹抽取外周靜脈血,ACD抗凝,用氯仿、飽和酚法提取DNA。

    1.4 KIR基因分型分析 用序列特異性引物PCR方法進(jìn)行KIR基因分型。測(cè)定的KIR基因包括抑制性 KIR:KIR2DL1、KIR2DL2/3,活化性 KIR:KIR2DS1、KIR2DS2以及框架基因 KIR2DL4。PCR反應(yīng)體系20 μl,其中模板 DNA 100 ng,上、下游引物終濃度 0.2 μmol/L,10 × PCR buffer 2 μl,MgCl21.6 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,Taq DNA 聚合酶0.5 U,加 ddH2O 至20 μl。反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性 1 min,循環(huán)參數(shù):96℃ 變性 25 s,65℃ 退火 45 s,72℃延伸30 s,進(jìn)行5個(gè)循環(huán);96℃變性25 s,60℃退火45 s,72℃延伸30 s,進(jìn)行21 個(gè)循環(huán);96℃變性 25 s,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,進(jìn)行5個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Alpha Imager TM2200生物圖像分析儀分析結(jié)果。每一個(gè)DNA模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng),以框架基因KIR2DL4作為PCR反應(yīng)效率的內(nèi)參照。

    1.5 HLA-C基因分型分析 用序列特異性引物PCR方法進(jìn)行HLA-C基因分型。測(cè)定的HLA-C基因?yàn)?HLA-Cw01-Cw08。PCR 反應(yīng)體系20 μl,其中模板 DNA 100 ng,上下游引物終濃度 0.5 μmol/L,2 ×PCR buffer 10 μl,dNTP 0.25 mmol/L,Taq DNA 聚合酶 0.5 U,加 ddH2O 至 20 μl。反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性7 min,循環(huán)參數(shù):96℃變性 30 s,68℃退火 45 s,72℃延伸60 s,進(jìn)行 5個(gè)循環(huán);96℃變性 30 s,63℃退火45 s,72℃延伸30 s,進(jìn)行21個(gè)循環(huán);96℃變性30 s,55℃退火 1 min,72℃ 延伸 2 min,進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物處理同上。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0軟件包處理,患者組與對(duì)照組之間KIR/HLA-C基因?qū)︻l率顯著性差異采用四格表卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 KIR/HLA-C基因?qū)︻l率在兩組間的比較 分別比較HT患者組和健康對(duì)照組KIR2DL1+HLAC2、KIR2DL2/3+HLA-C1、KIR2DS1+HLA-C2 和KIR2DS2+HLA-C1四對(duì)KIR/HLA-C基因?qū)Φ念l率(圖1),四對(duì)基因?qū)圆煌l率表達(dá),與對(duì)照組相比,HT患者組外周血中KIR2DS2+HLA-C1基因?qū)︻l率顯著升高(36.36%vs 16.28%,P <0.05),其余3對(duì)基因?qū)?KIR2DL1+HLA-C2、KIR2DL2/3+HLA-C1和KIR2DS1+HLA-C2在HT組和對(duì)照組頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.2 各HLA-C基因頻率在兩組間的比較 分別比較 HLA-C1(HLA-Cw02、04、05、06)和 HLA-C2(HLA-Cw01、03、07、08)兩組 HLA-C 基因,兩組HLA-C基因在外周血中呈不平衡表達(dá),其中HLACw03和HLA-Cw08基因在HT患者中頻率較健康對(duì)照者減低,兩組相比差異有顯著性(15.91%vs 40.70%,26.14%vs 47.67%,P 均 <0.05)。但是總的HLA-C1和HLA-C2頻率在兩組間無顯著性差異(表1)。

    圖1 4對(duì)基因?qū)υ趦山M人群中頻率的差異性比較Fig.1 Frequencies of four KIR/HLA-C gene-pairs in HT patients in comparison with healthy controls

    表1HLA-C1和HLA-C2基因頻率比較Tab.1 Frequencies of HLA-C1 and HLA-C2 genes in patients compared with control subjects

    3 討論

    近年來,關(guān)于KIR基因與疾病間關(guān)系的研究屢見不鮮,越來越多證據(jù)表明,特定的KIR基因型在腫瘤、病毒感染、妊娠流產(chǎn)及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6-9]。根據(jù)我們之前的研究,KIR多態(tài)性與HT的發(fā)病相關(guān),其中抑制性KIR基因KIR2DL5可能是HT發(fā)病的保護(hù)因子[10]。但是隨著研究的深入,研究者們發(fā)現(xiàn)在判斷KIR生物學(xué)效應(yīng)時(shí),應(yīng)同時(shí)分析其與HLA配體的配對(duì)情況,KIR只有通過與特異性HLA配體結(jié)合才能發(fā)揮對(duì)NK細(xì)胞和T細(xì)胞免疫活性的調(diào)節(jié)作用。例如,單獨(dú)分析KIR頻率時(shí),黑色素瘤患者和1型糖尿病患者的KIR頻率與正常人群相似;而分析KIR受體與HLA配體基因?qū)r(shí),發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者的抑制性KIR/HLA-C基因?qū)︻l率較正常人群低[11],1型糖尿病患者活化性基因?qū)︻l率較正常人群高[12]。到目前為止,國(guó)內(nèi)外有關(guān)HT患者KIR與HLA受體配體基因?qū)Φ难芯旷r有報(bào)道,因此,我們?cè)谝酝芯康幕A(chǔ)上,又延伸了對(duì)HT患者和健康對(duì)照人群KIR/HLAC受體配體基因?qū)︻l率差別的研究。

    我們應(yīng)用PCR-SSP方法分析兩組人群間4對(duì)不同KIR/HLA-C基因?qū)︻l率的差別,結(jié)果顯示只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率在兩組人群中有顯著性差異,并且HT患者頻率明顯高于健康人群(36.36%vs 16.28%,P < 0.05),雖然 HLACw03和HLA-Cw08在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是總體HLA-C1和HLA-C2頻率并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,不能作為判定HLA-C基因有意義的標(biāo)準(zhǔn)。以往Faridi等[8]應(yīng)用PCR-SSP方法研究了早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的KIR和HLA基因組合,發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者KIR2DL1/HLA-C2基因頻率低于正常早孕婦女,而活化性KIR2DS2/HLA-C1基因頻率則明顯高于患者,表明抑制性和活化性KIR/HLA-C基因均可能與習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。國(guó)內(nèi)徐金娥等[13]做了類似的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且患者組頻率高于對(duì)照組。Yen等[9]用同樣的方法對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者做了研究,發(fā)現(xiàn)患者KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率較健康對(duì)照者高。HT、習(xí)慣性流產(chǎn)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生均與自身免疫功能異常相關(guān),以上研究結(jié)果均提示抑制性和(或)活化性KIR/HLA-C基因?qū)赡茉谧陨砻庖咝约膊〉陌l(fā)病中起作用。

    對(duì)健康人而言,抑制性KIR/HLA受配體對(duì)可避免機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病,因此,抑制性受配體基因?qū)λ急壤胶馐蔷S持機(jī)體免疫狀態(tài)的重要條件,而活化性KIR/HLA受配體對(duì)主要增強(qiáng)機(jī)體免疫功能以抵抗病原體的入侵,但是它的活化作用往往異常,這又可能成為自身免疫性疾病的易感因素[14]。NK細(xì)胞和T細(xì)胞是機(jī)體重要的具有免疫功能的細(xì)胞,表達(dá)在NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面的KIR受體,通過與特異性 HLA-C類分子結(jié)合,向NK/T細(xì)胞傳遞活化性或抑制性信號(hào),調(diào)節(jié)NK/T細(xì)胞功能[15]。正常情況下,活化性受體和抑制性受體傳遞的兩種信號(hào)總和平衡,使得NK/T細(xì)胞功能穩(wěn)定,可耐受自身正常細(xì)胞[16,17]。如果活化性 KIR/HLA-C組合頻率超過了抑制性受配體組合頻率,NK/T細(xì)胞接受的活化性信號(hào)就多于抑制性信號(hào),對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用就強(qiáng),有可能對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞進(jìn)行攻擊。相反,如果抑制性信號(hào)多于活化性信號(hào),NK/T細(xì)胞的殺傷作用就會(huì)相對(duì)較弱,損傷靶細(xì)胞的能力相對(duì)減低,不會(huì)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞造成損傷[18]。

    本研究結(jié)果顯示,與健康人群相比,HT患者外周血活化性KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率增加,可能通過影響活化性與抑制性KIR/HLA-C受配體對(duì)之間的平衡,使NK/T細(xì)胞的激活閾值下降,易于被自身抗原激活,破壞機(jī)體的免疫穩(wěn)定狀態(tài),異常激活的NK/T細(xì)胞可直接殺傷自身甲狀腺細(xì)胞造成甲狀腺組織過度破壞,導(dǎo)致HT相關(guān)臨床癥狀的發(fā)生。現(xiàn)已證實(shí),CD4+輔助性 T細(xì)胞(T helper,Th)的Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在HT發(fā)病中起主導(dǎo)作用[19,20],異常激活的 NK/T細(xì)胞也可分泌 TNF-α、IFN-γ等Th1細(xì)胞因子從而間接誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致自身甲狀腺組織破壞,致使HT的發(fā)生。

    綜上所述,HT患者外周血中KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率增高,使NK/T細(xì)胞功能異常導(dǎo)致機(jī)體自身免疫功能紊亂,可能是引起HT發(fā)病的免疫遺傳學(xué)因素之一。對(duì)KIR/HLA-C基因?qū)Φ姆治鰹檠芯縃T的發(fā)病機(jī)制提供了新的方法,為今后橋本甲狀腺炎的早期診斷早期治療開辟新的思路。但是有關(guān)KIR、HLA-C基因在mRNA、蛋白等表達(dá)水平的研究仍不完善,有待今后進(jìn)一步深入的研究。

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