miR-508-5p慢病毒過表達載體構(gòu)建及對MAPK1/ERK信號通路靶向抑制作用的研究①

白 靜 范維寧 邢譯文 張 濤 周林林 徐廣賢 (寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院，銀川750004)

microRNA是一種約21～25 nt長的單鏈小分子RNA，在進化中具有高度的保守性。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列單鏈RNA[1]。成熟的miRNA通過和其靶基因3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合，導(dǎo)致 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，簡稱 RISC)降解其靶mRNA或阻礙其靶mRNA的翻譯[2]。miRNA能夠作用于多個靶標(biāo)調(diào)控基因表達，發(fā)揮多效性功能。在生物的整個發(fā)育過程中miRNA可能有調(diào)節(jié)細胞早期發(fā)育，參與固有免疫細胞生長分化和免疫應(yīng)答，調(diào)控基因表達的生物功能[3]。當(dāng)機體受到微生物感染時，miRNA可通過調(diào)控模式識別受體信號通路及產(chǎn)生的細胞因子，負性或正性調(diào)控固有免疫應(yīng)答[4]。最近的研究表明miRNAs與眾多細胞通路的免疫應(yīng)答有關(guān)，其中包括TLRs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB[6]，參與 AKT[7]和 MAPK1/ERK 信號通路調(diào)節(jié)[8]。ERK(Extracellular signalregulated kinase)信號通路是細胞增殖和細胞分化的中心調(diào)節(jié)因子[9，10]。ERK激活已被證實與許多人類惡性腫瘤的發(fā)病機制和細胞周期有關(guān)[11]。miR-508-5p與MAPK1/ERK信號通路有怎樣的聯(lián)系還未可知，因此本文通過構(gòu)建pSicoR-miR-508-5p過表達載體，及其潛在靶基因MAPK1/ERK 3'UTR熒光素酶報告載體及突變體，通過一系列分子生物學(xué)方法驗證miR-508-5p與MAPK1的靶向關(guān)系，為進一步闡明miRNA在細胞免疫學(xué)信號通路及細胞周期中發(fā)揮的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(Tiangen);T4連接酶、Hpa1、Xho1、Xba1、Spe1、MLU1 限 制 性 內(nèi) 切 酶(TaKaRa生物工程公司，大連);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS(Hyclone公司，美國);TransLipid Transfection Reagent 2000轉(zhuǎn)染試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京);鼠抗 MAPK1抗體(Abgent);雙熒光素酶檢測試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega生物公司);2×SYBR green1 Mix(TaKaRa生物工程公司);hsa-miR-508-5P、MAPK1 3'-UTR引物序列由三博遠志公司合成;DNA測序由重慶金瑞斯生物有限公司完成;real-time PCR引物由上海華大基因有限公司合成;miR-508 inhibitor引物序列由上海吉瑪有限公司合成;pSicoR、Report、HEK-293T 細胞、大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 miR-508-5p shRNA序列的設(shè)計 參照miRBase數(shù)據(jù)庫人源hsa-miR-508-5P基因序列(MIMAT0004778):5'-UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG-3'(length=23)，設(shè)計一對寡核苷酸鏈，含有miR-508-5p序列和miR-508-5p反向互補序列，退火后能形成含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體序列，并在序列兩端分別加上Hpa1和Xho1酶切位點，上游序列:5'-TTACTCCAGAGGGCGTC ACTCATGTTCAAGAGACATGAGTGACGCCCTCTGGAGTATTTTTTC-3';下游序列:5'-TCGAGAAAAAATACTCCAGAGGGCGTCACTCATGTCTCTTGAACATGAGTGACGCCCTCTGGAGTAA-3'由三博遠志有限公司合成。

1.2.2 miR-508-5p雙鏈DNA Oligo的制備 取微量合成的miR-508-5p-F和miR-508-5p-R，稀釋至終濃度為10 μmol/L，在室溫下配制20 μl反應(yīng)體系:miR-508-5p-F(10 μmol/L)和 miR-508-5p-R(10 μmol/L)各取5 μl，加入2 μl的10 ×Oligo 退火緩沖液，8 μl的 RNase-Free水;輕微混勻，95℃ 水浴 5 min;反應(yīng)結(jié)束后，將離心管取出，室溫靜置緩慢降溫;退火完成后，將離心管點離5 s，使管壁上的液體離至管底，混勻，-20℃貯存。

1.2.3 預(yù)測靶基因MAPK1 3'-UTR引物設(shè)計與擴增 參照NCBI數(shù)據(jù)庫和miRBase數(shù)據(jù)庫，設(shè)計與miR-508-5p序列部分互補的人源MAPK1 3'-UTR及突變體(表1)。上游引物酶:MLU1;下游引物酶:Spe1。建立40 μl PCR反應(yīng)體系:2×PCR Mix 20 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 16 μl。

1.2.4 miR-508-5p重組慢病毒載體及靶基因表達載體的構(gòu)建與鑒定 將經(jīng)過Hpa1和Xho1限制性內(nèi)切酶雙酶切的pSicoR質(zhì)粒，以及經(jīng)過MLU1和Spe1限制性內(nèi)切酶雙酶切的Report質(zhì)粒，用12%的瓊脂糖凝膠跑電泳并對目的條帶進行膠回收，分別將線性化的pSicoR質(zhì)粒與雙鏈miR-508-5p DNA片段連接，將線性化的Report質(zhì)粒與MAPK1 3'-UTR連接，反應(yīng)條件為22℃，2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒 DNA，分別用 Xba1、Xho1及 MLU1、Spe1限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定并測序。取測序正確后的克隆，搖菌擴大培養(yǎng)，用除內(nèi)毒素大提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用于病毒包裝及雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證。

表1 預(yù)測靶基因MAPK1 3'-UTR引物Tab．1 MAPK1 3'-UTR primer of predicted target gene

1.2.5 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶向抑制作用 將293T細胞接種于96孔板，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達到1×107ml-1。將 pSicoR-miR-508-5p過表達載體和Report-MAPK1 3'-UTR載體共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，同時共轉(zhuǎn)染Report-MAPK1-mutant載體及miR-508-5p inhibitor(5'-CAUGAGUGACGCCCUCUGGAGUA-3')做對照。每組共轉(zhuǎn)染PRL-TK海蜃熒光素酶做為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染試劑為Tranglipid Transfection Regent。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光發(fā)光情況，并裂解細胞，按照promega雙熒光素酶試劑盒說明書進行操作，所用儀器為微孔板發(fā)光分析儀。

1.2.6 Western blot法檢測 MAPK1蛋白表達 在6孔板接種293T細胞，調(diào)整好細胞密度，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pSicoR-miR-508-5p過表達載體和miR-508 inhibitor共轉(zhuǎn)染至293T細胞，48 h后觀察GFP的表達情況，按照凱基提全蛋白試劑盒說明書提全蛋白，-80℃分裝保存。提取的蛋白進行BCA法定量，SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜后，加入鼠抗的MAPK1抗體(1∶1 000)，室溫搖晃孵育2 h后4℃ 過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)孵育2 h，充分洗膜后利用ECL化學(xué)發(fā)光法進行暗室曝光。GAPDH作為內(nèi)源性參照。

1.2.7 real-time PCR法檢測細胞miR-508-5p的表達水平及MAPK1 mRNA含量 同上方法將pSicoR-miR-508-5p過表達載體和miR-508 inhibitor共轉(zhuǎn)染至293T細胞，48 h后觀察GFP的表達情況，加入TRIZOL試劑裂解細胞，提取全RNA。按照promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計miR-508的特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物(5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCATGAGTG-3')以及各qRT-PCR引物(表2)。利用羅氏2.0 Real-time PCR儀，采用SYBR Green1染料法對293T細胞中miR-508-5P的表達量及MAPK1 mRNA含量進行檢測，U6及β-actin作為內(nèi)參基因，結(jié)果采用相對定量法，公式為 2-△△CT。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所測數(shù)據(jù)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pSicoR-miR-508-5p及Report-MAPK1的鑒定 pSicoR空質(zhì)粒7 567 bp，重組質(zhì)粒pSicoR-miR-508-5p通過Xho1和Xba1限制性內(nèi)切酶雙酶切后被切成兩個片段:大片段約7.3 kb，小片段約為395 bp，空質(zhì)粒小片段約為334 bp。重組質(zhì)粒Report-MAPK1通過Spe1和MLU1限制性內(nèi)切酶雙酶切后成兩個片段:大片段約6.1 kb，MAPK1約330 bp，提示外源序列插入成功(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒的測序結(jié)果

2.2.1 pSicoR-miR-508-5p過表達載體測序結(jié)果，DNA測序結(jié)果證明目的片段序列與預(yù)期一致，成功地克隆到慢病毒表達載體中(圖2)。

2.2.2 預(yù)測靶基因測序結(jié)果，其中MAPK1約330 bp(圖3)，下劃線部分為與hsa-miR-508-5p互補的序列。

表2 各基因qRT-PCR引物Tab．2 The qRT-PCR primers of genes

圖1 pSicoR-miR-508-5p和預(yù)測靶基因Report-MAPK1 3'-UTR雙酶切圖Fig．1 Double digestion figures of pSicoR-miR-5p and Report-MAPK1 3'-UTR of predicted target gene

圖2 pSicoR-miR-508-5p過表達載體測序結(jié)果Fig．2 Sequencing results of pSicoR-miR-508-5p over expression vector

圖3 Report-MAPK1 3'-UTR重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig．3 Sequencing results of report-MAPK1 3'-UTR plasmid

圖4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-508-5p與MAPK1靶向抑制作用，共轉(zhuǎn)染海蜃熒光素酶做內(nèi)對照Fig．4 To varify the targeted inhibition between miR-508-5p and MAPK1 with luciferase reporter system，co-transfection luciferase of sea mirage as an internal control

2.3 雙熒光素酶報告系統(tǒng) hsa-miR-508-5p過表達載體組明顯抑制MAPK1的熒光素酶活性，與正常對照組相比下降約6倍(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染了hsa-miR-508-5p inhibitor組，MAPK1的熒光素酶活性又明顯升高約1.5倍(P＜0.05)。hsa-miR-508-5p對mut-MAPK1沒有作用。證實hsa-miR-508-5p能靶向作用于MAPK1 3'-UTR互補位點，抑制其表達，而敲除其作用位點，不具有靶向關(guān)系(圖4A)。同時列出了MAPK1熒光素酶相對活性及miR-508-5p與MAPK1靶向位點預(yù)測(圖4B)。

2.4 重組過表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293T 利用脂質(zhì)體將鑒定的陽性重組pSicoR-miR-508-5p表達載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞，相差顯微鏡下觀察GFP熒光表達情況(圖5)。

2.5 Western blot 通過Western blot法檢測MAPK1蛋白的表達水平，證實感染 pSicoR-miR-508-5p重組慢病毒的293T細胞中 MAPK1蛋白表達量較正常293T細胞中明顯降低，而轉(zhuǎn)染了miR-508 inhibitor組 MAPK1蛋白表達水平又明顯升高(圖6)，說明pSicoR-miR-508-5p直接靶標(biāo)MAPK1 3'-UTR，下調(diào)其蛋白的表達水平。

圖5 A/B:pSicoR-miR-508-5p重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞48 h(×10，×40)Fig．5 A/B:pSicoR-miR-508-5p recombinant plasmid transfected HEK-293T cells at 48 h(×10，×40)

圖6 Western blot檢測MAPK1蛋白表達水平，GAPDH做內(nèi)參Fig．6 To detect protein expression level of MAPK1 with western blot analysis，GAPDH as an internal reference

圖7 real-time PCR檢測miR-508-5p和mRNA相對表達水平Fig．7 To detect relative expression level of miR-508-5p and mRNA with real-time PCR

2.6 real-time PCR法檢測miR-508-5p的相對含量及MAPK1 mRNA的相對表達水平 轉(zhuǎn)染了pSicoR-miR-508-5p過表達載體組，miR-508-5p的表達水平上調(diào)約7倍(P＜0.05)，而MAPK1 mRNA表達水平下調(diào)約14倍(P＜0.05);轉(zhuǎn)染了pSicoR-miR-508-5p inhibitor組，miR-508-5p的表達水平下調(diào)約 6倍(P＜0.05)，而MAPK1 mRNA表達水平上調(diào)約7倍(P＜0.05)(圖7)。進一步證實miR-508-5p直接靶標(biāo)MAPK1的表達。

3 討論

成熟的microRNA(miRNA)是一種長19～25 nt的非編碼 RNA，通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一靶基因，由此形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精細調(diào)控基因的表達[12]。Cui等[13]發(fā)現(xiàn)，近30%的信號網(wǎng)絡(luò)蛋白(總共159個)為miRNA的靶基因。而在人類基因組中，miRNA的靶基因僅占總基因數(shù)的17%左右，這似乎提示與其他蛋白相比，miRNA更傾向于靶標(biāo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號途徑存在于所有生物體內(nèi)的大多數(shù)細胞內(nèi)，是真核生物細胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可將細胞表面信號刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)，與細胞增殖、存活、分化、凋亡等生理過程密切相關(guān)。到目前為止，在哺育動物細胞中已至少發(fā)現(xiàn)有3條MAPK通路，細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-term-inal kinase，JNK)通路和p38MAPK通路[14]。MAPK信號通路是一個廣譜的信號途徑，由該基因編碼的蛋白質(zhì)是MAP激酶家族的成員，MAP激酶。也被稱為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，作為多種生化信號的結(jié)合點，并參與多種細胞過程，如細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育。IL-6促進細胞在成熟階段的自噬過程，與持續(xù)的MAPK1/ERK活化狀態(tài)有關(guān)系，ERK通過調(diào)節(jié)下游信號因子IL-6，促進細胞的成熟[15]。此外發(fā)現(xiàn)ERK與酵母中的兩種蛋白激酶KSS-1和FUS-3有著驚人的相似性。這些酵母激酶在調(diào)節(jié)細胞周期時起作用，由此提示ERK1/2在真核細胞對細胞外信號應(yīng)答時可調(diào)節(jié)細胞周期[16]。

已有研究證實過表達的miR-508-3p能抑制腎癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并且抑制細胞遷移，成為腎癌的一個抑癌基因[17]。我們推測miR-508-5p可能在細胞信號通路與免疫學(xué)調(diào)控方面發(fā)揮作用，因此本文首先通過 miRBase、TargetScan、miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測了hsa-miR-508-5p的潛在靶基因MAPK1，構(gòu)建了具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA引物以及互補mRNA的3'-UTR，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot和real-time PCR實驗，反復(fù)驗證了miR-508-5p與MAPK1 3'-UTR具有直接靶向關(guān)系，在轉(zhuǎn)錄后水平對其進行負調(diào)控，初步驗證了miR-508-5p在細胞信號通路可能發(fā)揮調(diào)控作用的假設(shè)。其具體的分子學(xué)機制以及如何影響下游信號因子從而發(fā)揮一系列調(diào)控作用，我們將在以后的研究中具體闡述。

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