兔軟骨下骨微損傷模型的建立

劉曉磊，薛祖軍，李曙光，劉克敏

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是骨科常見病，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，病變主要發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨，但病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。1986年，Radin等首先提出軟骨下骨硬化可能是導(dǎo)致軟骨損傷的重要因素[1]。

目前國(guó)內(nèi)外鮮有軟骨下骨損傷模型的報(bào)道，尚無公認(rèn)的軟骨下骨微損傷的動(dòng)物模型。我們遵循重物墜落致傷原理設(shè)計(jì)制造了膝關(guān)節(jié)打擊器，通過撞擊髕股關(guān)節(jié)及股骨外側(cè)髁，模擬臨床常見膝關(guān)節(jié)受傷方式，制作兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨微損傷動(dòng)物模型，并評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 打擊器

由作者自行設(shè)計(jì)，中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所協(xié)助制作。

膝關(guān)節(jié)打擊器主要由4部分組成：機(jī)械架、下肢固定支撐系統(tǒng)、電磁環(huán)路系統(tǒng)和重物(圖1)。

機(jī)械架包括1個(gè)底板、2根立柱系統(tǒng)、1塊矩形橫梁、2根導(dǎo)向桿。橫梁可在50 cm范圍內(nèi)升降。

下肢膝關(guān)節(jié)支撐固定系統(tǒng)有支撐、合葉板和軸組成。支撐為“T”形，用以支撐橫軸，使用螺釘固定于系統(tǒng)底板之上；橫軸用以支撐膝關(guān)節(jié)，固定于支撐上；腿部支板為改良后的合葉結(jié)構(gòu)，穿套于橫軸之上，可實(shí)現(xiàn)合葉間夾角的變化和調(diào)整。

電磁環(huán)路系統(tǒng)由電源盒和電磁吸附裝置組成，電源盒將220 V交流電轉(zhuǎn)變?yōu)?4 V直流電，并設(shè)保險(xiǎn)管及開關(guān)。電磁環(huán)路系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)吸附、釋放重物，使重物沿導(dǎo)向桿自由墜落。

重物由重物支架和砝碼組成。重物支架頂部為吸附盤，用以與電磁吸附裝置連接；兩側(cè)有導(dǎo)向孔。

圖1 膝關(guān)節(jié)打擊器

1.2 建模方法

7～9月齡新西蘭大白兔12只，雌性，普通級(jí)，體質(zhì)量2.5～3.8 kg，北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，批號(hào)SCXK京2007-0003。

取6只兔為A組，其中6個(gè)膝關(guān)節(jié)為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)為對(duì)照組。20%烏拉坦750 mg/kg耳緣靜脈麻醉。撞擊前仔細(xì)檢查后腿膝關(guān)節(jié)無異常。將兔仰臥于木質(zhì)平板上，左膝屈曲120°固定于不銹鋼下肢支撐。1.74 kg重物從30 cm高沿導(dǎo)向桿自由落下，撞擊兔髕股關(guān)節(jié)；即刻移除重物。撞擊前后分別行X線檢查；撞擊24 h行MRI檢查。

另6只兔為B組，其中6個(gè)膝關(guān)節(jié)為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)為對(duì)照組。麻醉方法同上。將兔俯臥于木質(zhì)平板上，髖關(guān)節(jié)屈曲外展，膝屈曲90°固定于木質(zhì)下肢支撐。1.14 kg重物從28 cm高撞擊兔股骨外側(cè)髁；即刻移除重物。撞擊前后分別行X線檢查，撞擊后6 d行MRI檢查。

1.3 影像學(xué)檢查

1.3.1 X線 撞擊前后兔仰臥位行后腿雙膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片，觀察撞擊前膝關(guān)節(jié)情況及撞擊膝關(guān)節(jié)有無骨折。

1.3.2 MRI X線未見明顯骨折線者，撞擊后24 h或6 d俯臥位將雙膝關(guān)節(jié)伸直位固定于寬5 cm硬紙板上，采用SIGNA Twinspeed 1.5 T型MRI(美國(guó)通用公司)行以下序列檢查：①矢狀、冠狀、軸位T1加權(quán)像，TR/TE 400/14.3，矩陣384×224，S/I；②矢狀、冠狀、軸位 T2加權(quán)像，TR/TE 3000/102，矩陣 384×224，S/I；③矢狀、冠狀、軸位T2壓脂像，TR/TE 3000/102，矩陣384×224，S/I。

所有序列均使用頸線圈，層厚3 mm，無間隔。

X線、MRI結(jié)果由兩名具有豐富經(jīng)驗(yàn)的高年資放射科醫(yī)生分析。

1.4 組織學(xué)觀察

MRI檢查后，兔空氣栓塞處死，立即解剖，取股骨髁置于4%多聚甲醛中固定3 d，甲酸脫鈣2周，石蠟包埋。股骨股骨髁部和髕面作5μm矢狀連續(xù)切片，HE染色。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有12只試驗(yàn)動(dòng)物無脫失，全部進(jìn)入分析。

實(shí)驗(yàn)組均未出現(xiàn)重物反彈和二次撞擊。A組1只撞擊后出現(xiàn)髕骨脫位。撞擊后，兔活動(dòng)頻次減少。所有撞擊側(cè)膝關(guān)節(jié)均可見腫脹，對(duì)照側(cè)膝關(guān)節(jié)正常。

2.2 影像學(xué)檢查

雙膝關(guān)節(jié)正側(cè)位片示所有12只兔髕骨、股骨均未見明顯骨折線。

MRI示A組實(shí)驗(yàn)組膝關(guān)節(jié)髕上囊和腘窩處均可見大量長(zhǎng)T1、長(zhǎng)T2信號(hào)，冠狀位可見股骨干骺端T1加權(quán)像低信號(hào)、T2加權(quán)像和脂肪抑制像低信號(hào)。對(duì)照組均未見異常影像。

B組1只兔膝關(guān)節(jié)MRI圖像質(zhì)量較差(該兔大腿外側(cè)可見T1加權(quán)像低信號(hào)、T2加權(quán)像和脂肪抑制像高信號(hào))，余5只兔實(shí)驗(yàn)組5個(gè)膝關(guān)節(jié)矢狀位T2脂肪抑制像可見股骨以遠(yuǎn)骺端長(zhǎng)T2壓脂密度信號(hào)，邊界不清，密度不均勻，占骺端1/3；T2加權(quán)像可見相同層面、相同位置略長(zhǎng)T2信號(hào)，異常信號(hào)范圍小于T2脂肪抑制像；T1加權(quán)像可見相同層面、相同位置略長(zhǎng)T1信號(hào)，異常信號(hào)范圍與T2加權(quán)像相當(dāng)。軸位T2脂肪抑制像可見股骨外側(cè)髁長(zhǎng)T2壓脂密度信號(hào)，其中伴有短T2信號(hào)，占股骨外側(cè)髁大部分；T2加權(quán)像可見股骨外側(cè)髁相同層面、相同位置略長(zhǎng)T2混雜信號(hào)，占股骨外側(cè)髁大部分；T1加權(quán)像可見股骨外側(cè)髁相同層面、相同位置略長(zhǎng)T1信號(hào)，其間混雜斑點(diǎn)狀、網(wǎng)狀信號(hào)(圖2)。對(duì)照組未見異常影像。

2.3 HE染色

實(shí)驗(yàn)組軟骨基質(zhì)著色均勻，軟骨細(xì)胞分層清晰；表層軟骨細(xì)胞呈梭形，近似水平排列，中間層呈散在無序排列，柱狀層呈柱狀排列；軟骨細(xì)胞未見形態(tài)大小和排列異常，潮線完整；軟骨下骨皮質(zhì)完整；骨小梁呈拱形，局部排列紊亂(B組)或連續(xù)性中斷(A組)；髓腔內(nèi)可見多處不規(guī)則排列大片紅細(xì)胞(圖3)。

對(duì)照組軟骨基質(zhì)成粉紅色，著色均勻；軟骨細(xì)胞核呈深藍(lán)色，胞漿呈粉紅色；表層軟骨細(xì)胞呈梭形，近似水平排列，中間層呈散在無序排列，柱狀層呈柱狀排列，其下方為潮線；鈣化軟骨層細(xì)胞較大，其下方為軟骨下骨皮質(zhì)和骨小梁。軟骨下骨區(qū)血管豐富，骨小梁呈拱形，排列規(guī)則；髓腔內(nèi)可見規(guī)則排列的紅細(xì)胞。

圖2 B組實(shí)驗(yàn)組MRI

圖3 HE染色

3 討論

Radin等[2]和Thompson等[3]分別建立慢性反復(fù)和急性單次撞擊骨關(guān)節(jié)炎模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨損傷可能是引起骨關(guān)節(jié)炎主要原因。2005年，Lahm等建立狗髕股關(guān)節(jié)軟骨下骨損傷模型[4]。以上3種模型均是撞擊髕股關(guān)節(jié)，而臨床膝關(guān)節(jié)軟骨下骨微損傷形式多樣，損傷機(jī)制十分復(fù)雜，單一動(dòng)物模型僅能反映一種損傷，不能滿足臨床軟骨下骨微損傷的各個(gè)方面需求。

比較理想的軟骨下骨微損傷模型應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：①閉合傷，具有良好的臨床相關(guān)性；②病理變化的一致性；③可控性和可重復(fù)性。

膝關(guān)節(jié)打擊器采用重物從不同高處下落撞擊致傷，與Haut[5]和Li[6]方法一致；通過電磁環(huán)路系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)吸附、釋放撞擊重物，確保重物方向一致性；下肢膝關(guān)節(jié)支撐固定系統(tǒng)采用合頁設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)屈曲角度的可調(diào)性；外固定小腿、大腿和骨盆，操作簡(jiǎn)單方便。

本研究通過撞擊髕股關(guān)節(jié)和股骨外側(cè)髁兩種方法制作軟骨下骨微損傷模型，實(shí)驗(yàn)組均未出現(xiàn)重物反彈和二次撞擊。組織病理學(xué)觀察顯示軟骨未受影響，軟骨下骨微損傷；建立的模型具有一致性、可重復(fù)性。

軟骨下骨微損傷，即骨挫傷，主要病理表現(xiàn)為骨髓出血、水腫，伴或不伴松質(zhì)骨微骨折[7-8]。MRI表現(xiàn)為T1加權(quán)像低信號(hào)，與高信號(hào)的正常骨髓信號(hào)對(duì)比明顯；T2加權(quán)像高信號(hào)；壓脂像高信號(hào)，與信號(hào)被抑制的鄰近正常骨髓形成鮮明對(duì)比[9-11]。

Escalas等建立兔骨挫傷模型，于傷后1、3、9周行MRI檢查，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)T1加權(quán)像低信號(hào)和T2加權(quán)像高信號(hào)，組織病理學(xué)僅見骨髓水腫和正常細(xì)胞的移位[11]。Ryu等對(duì)14個(gè)豬脛骨近端干骺端骨挫傷區(qū)組織病理學(xué)和傷后當(dāng)天MRI檢查發(fā)現(xiàn)，組織病理學(xué)顯示骨髓水腫出血者，其T1加權(quán)像表現(xiàn)為低信號(hào)、線性低信號(hào)和未見異常信號(hào)，T2加權(quán)像表現(xiàn)為高信號(hào)、低信號(hào)和未見異常信號(hào)；嚴(yán)重出血區(qū)表現(xiàn)為T1、T2加權(quán)像和T2壓脂像均為低信號(hào)；出血水腫混合區(qū)表現(xiàn)為彌漫性低信號(hào)[12]。

本研究A組傷后24 h股骨髁干骺端出現(xiàn)T1加權(quán)像、T2加權(quán)像低信號(hào)和T2脂肪抑制序列低信號(hào)，組織病理學(xué)顯示骨小梁呈拱形，局部排列紊亂或連續(xù)性中斷，髓腔內(nèi)可見多處不規(guī)則排列大片紅細(xì)胞。與Ryu等研究的較重?fù)p傷病理結(jié)果一致[12]。B組傷后3 d行MRI檢查，所有序列均未見異常信號(hào)；傷后6 d MRI表現(xiàn)為T1加權(quán)像低信號(hào)、T2加權(quán)像及T2壓脂像高信號(hào)。與文獻(xiàn)描述結(jié)果一致[11-12]。不同程度損傷MRI表現(xiàn)各不相同，較輕的損傷引起骨髓水腫，MRI表現(xiàn)為T1加權(quán)像低信號(hào)和T2加權(quán)像高信號(hào)；若外力增加，損傷加重，則會(huì)導(dǎo)致骨梁骨折、微骨折和出血，MRI表現(xiàn)為T1、T2加權(quán)像和T2壓脂像均為低信號(hào)或彌漫性低信號(hào)。

Blankenbaker等報(bào)道一名髖關(guān)節(jié)半脫位運(yùn)動(dòng)員，傷后2 h行MRI檢查未見異常信號(hào)，3個(gè)月后復(fù)查發(fā)現(xiàn)股骨頭前上出現(xiàn)骨水腫信號(hào)[13]。他們建立豬髕股關(guān)節(jié)骨挫傷模型，并于傷后1、6、12和30 h分別行MRI檢查，結(jié)果顯示創(chuàng)傷后MRI出現(xiàn)骨挫傷表現(xiàn)最早在傷后1 h，也可延遲至傷后30 h[13]。

本研究以股骨髁為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后1 d和3 d，MRI均未見異常信號(hào)；傷后6 d出現(xiàn)明顯骨挫傷表現(xiàn)，較30 h[13]落后，可能與創(chuàng)傷較重致出血有關(guān)。以上結(jié)果提示，臨床若MRI早期檢查陰性，但患者存在持續(xù)疼痛和活動(dòng)受限，應(yīng)在傷后5～7 d復(fù)查。

膝關(guān)節(jié)股骨髁處骨髓腔內(nèi)含有豐富的骨髓，髓腔內(nèi)脂肪在MRI表現(xiàn)為短T1加權(quán)和中長(zhǎng)T2加權(quán)信號(hào)。外力作用使骨髓局部水腫、充血，表現(xiàn)為明顯的長(zhǎng)T1、長(zhǎng)T2信號(hào)，常規(guī)T1加權(quán)和T2加權(quán)可以顯示骨損傷[14]；若將脂肪信號(hào)去除，則可更清晰有效地顯示出血水腫信號(hào)。脂肪抑制序列[10]通過抑制骨髓腔內(nèi)脂肪信號(hào)來顯示骨髓水腫、充血等含水豐富組織的信號(hào)，是診斷軟骨下骨損傷最為有效的影像檢查手段[15]。本研究顯示，T2脂肪抑制序列顯示病變范圍較T1加權(quán)和T2加權(quán)檢出范圍大，邊界也更加清晰。

國(guó)外有研究采用不同方法撞擊髕股關(guān)節(jié)[3-4]。國(guó)內(nèi)對(duì)軟骨下骨微損傷的臨床研究較少，更缺乏相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，中文文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)有關(guān)軟骨下骨微損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。本研究采用撞擊股骨外側(cè)髁方式，既避免了撞擊髕股關(guān)節(jié)力量經(jīng)髕骨傳至股骨和腘窩處軟組織緩沖等不確定因素，又模擬了臨床常見的膝關(guān)節(jié)致傷機(jī)制，具有良好的臨床相關(guān)性。

進(jìn)一步研究應(yīng)改進(jìn)下肢固定裝置，確保打擊部位一致和受到撞擊時(shí)最小移動(dòng)；改進(jìn)并實(shí)現(xiàn)致傷加速度可變、可控，以期得到更多可監(jiān)控、分析的相關(guān)信息，充分模擬臨床上不局限于重力加速度的損傷方式；進(jìn)一步驗(yàn)證其信度和效度。

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