葡萄籽原花青素對腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激與學(xué)習(xí)記憶的影響

王珠，趙雅寧，李建民

視空間工作記憶是工作記憶模式的一個系統(tǒng)，不同的腦區(qū)負責(zé)不同視空間信息的加工。視覺空間認知障礙是指由于視覺空間認識機能失調(diào)造成物體在空間內(nèi)的各種特性的認識障礙，也叫視覺性空間知覺障礙[1]。研究顯示，腦損傷可引起視覺空間認知障礙，臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，嚴重者導(dǎo)致神經(jīng)退行性變甚至癡呆，不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且增加家庭和社會的經(jīng)濟負擔(dān)，但其機制尚未明確[2]。本研究觀察不同劑量葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)預(yù)處理，對腦缺血再灌注損傷后視覺空間認知障礙的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級健康Sprague-Dawley大鼠72只，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所動物資源中心提供，實驗動物合格證號：0127011。常規(guī)飼養(yǎng)，溫度(24±1)℃，濕度(55±5)%。手術(shù)前夜禁食，不禁水。

1.2 試劑和儀器

GSPE：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，用蒸餾水溶解成所需濃度。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒：南京建成生物工程研究所。

尼龍魚線，直徑0.235 mm：日本法可株式會社。光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS。石蠟切片機：LEICA。HH-S恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠。KDC-1044離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。HANGPING FA-2004電子天平：上海天平儀器廠。S2-96自動純水蒸餾器：上海亞榮升華儀器廠。

1.3 分組與預(yù)處理

將動物分成假手術(shù)組、模型組、GSPE低劑量組(20 mg/kg)和GSPE高劑量組(200 mg/kg)，每組18只。GSPE低、高劑量組造模前每天按設(shè)計劑量灌胃給藥1次，連續(xù)4周。假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水10 ml/kg。

1.4 模型制備

預(yù)處理4周后，參考改良Longa方法造模[3]。大鼠術(shù)前禁食12 h，用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。分離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈靠近分叉端。距頸總動脈分叉處約5 mm剪一小口，將魚線從剪口處插入并旋轉(zhuǎn)，使魚線進入頸內(nèi)動脈。向頭端緩慢推進18～20 mm，感到有阻力時，即到達大腦前動脈，阻斷大腦中動脈(MCA)的血液供應(yīng)。結(jié)扎頸內(nèi)動脈。2 h后抽出魚線，血流再灌注。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，然后縫合傷口。

術(shù)后大鼠完全清醒后參照Longa評分法[4]進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3分為造模成功。

1.5 觀察指標

于再灌注后12 h、24 h、48 h每組各取6只大鼠，進行以下實驗。

1.5.1 Morris水迷宮 將安全島置于水迷宮第二象限中，加水至高過安全島2～3 cm，水溫22～25℃。由攝像機及計算機自動跟蹤、拍攝和統(tǒng)計大鼠分別由4個象限入水后尋找到安全島的潛伏值和穿臺次數(shù)。如在90 s內(nèi)未找到安全島，則潛伏期值記為90 s。

1.5.2 HE染色 大鼠4%多聚甲醛灌注固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚4μm，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.5.3 SOD測定 采用黃嘌呤氧化酶法。將凍存的腦組織勻漿樣本解凍，取0.05 ml，漩渦混勻器充分混勻，37℃恒溫水浴40 min，室溫放置10 min，于波長550 nm處比色。計算SOD水平。

1.5.4 MDA測定 采用硫代巴比妥酸法。將凍存的腦組織樣本解凍，取0.05 ml，95℃水浴40 min，流水冷卻，3500～4000 r/min離心10 min，取上清，于532 nm處，1 cm光徑比色。計算MDA水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用表示，各組間均數(shù)比較進行方差分析和t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

假手術(shù)組大鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊。模型組大鼠缺血區(qū)可見較多腫脹神經(jīng)元，部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)，胞體縮小變形，出現(xiàn)核固縮和核仁消失現(xiàn)象，胞質(zhì)變少、著色深，間質(zhì)水腫明顯，可見大量壞死細胞，腦組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重。GSPE低劑量組缺血區(qū)可見腫脹的神經(jīng)元，部分出現(xiàn)壞死形成空泡狀結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元細胞出現(xiàn)縮小變形、核固縮和較多空泡。GSPE高劑量組可見較多殘存神經(jīng)細胞，神經(jīng)元形態(tài)相對正常，間質(zhì)水腫較輕，核固縮細胞和空泡區(qū)域明顯減少。見圖1。

2.2 Morris水迷宮

與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期和穿臺次數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P<0.001)。與模型組比較，GSPE低劑量組潛伏期和穿臺次數(shù)差距不大，GSPE高劑量組潛伏期和穿臺次數(shù)顯著低于模型組(P<0.001)，也顯著低于GSPE低劑量組(P<0.001)。見表1、表2。

表1 各組大鼠Morris水迷宮潛伏期(s)

表2 各組大鼠Morris水迷宮穿臺次數(shù)

2.3 SOD

假手術(shù)組腦組織SOD含量各時間點間無明顯變化。與假手術(shù)組相比，各時間點模型組SOD含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，GSPE低劑量組各時間點SOD含量略高，但無顯著性差異(P>0.05)；GSPE高劑量組各時間點SOD含量高于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠SOD水平(U/mg)

圖1 各組大鼠缺血區(qū)腦組織(HE染色,400×)

2.4 MDA

假手術(shù)組腦組織內(nèi)MDA含量穩(wěn)定。與假手術(shù)組比較，各時間點模型組MDA含量增多(P<0.05)。與模型組比較，GSPE低劑量組MDA無顯著性差異(P>0.05)。GSPE高劑量組MDA低于模型組(P<0.05)和GSPE低劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠MDA水平(nmol/mg)

3 討論

Katherine等認為，枕葉皮質(zhì)－頂葉后部－前額葉神經(jīng)環(huán)路參與工作記憶過程，其中背外側(cè)前額葉參與空間工作記憶過程[5]。何婧等發(fā)現(xiàn)，帕金森病(PD)患者存在肯定的視覺空間工作記憶損害，且隨病程進展加重[6]。姜紅等發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射骨髓間充質(zhì)干細胞能改善癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的視空間記憶[7]。

本研究顯示，腦缺血再灌注大鼠表現(xiàn)出明顯視空間記憶障礙。已有研究證實，氧自由基在腦缺血再灌注損傷早期就有形成，是直接導(dǎo)致細胞死亡和繼發(fā)性細胞死亡的主要因素[8]。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致記憶認知功能障礙，氧化應(yīng)激強度與持續(xù)時間決定著它對學(xué)習(xí)記憶影響的程度，其機制為氧自由基增多，興奮性氨基酸毒性增加，導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶等腦高級功能損害[9]。裴新榮等發(fā)現(xiàn)，海洋膠原肽具有預(yù)防年齡造成的學(xué)習(xí)記憶能力下降的功能，其作用機制可能是抗氧化活性和促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達[10]。

GSPE是從葡萄籽中提取的生物類黃酮，具有極強的抗氧化和清除自由基活性，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑[11]。本研究結(jié)果顯示，大劑量GSPE能明顯減輕腦缺血再灌注大鼠的視空間記憶功能和神經(jīng)細胞損傷，對缺血再灌注損傷具有保護作用。

[1]席春華,朱幼玲,汪凱.視空間工作記憶的研究進展[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2008,34(7):443-445.

[2]姜巍,鄭健,趙士福.缺血性腦白質(zhì)損害患者視覺空間工作記憶的事件相關(guān)電位特征[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2009,22(5):480-484.

[3]曹勇軍,程彥斌.線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的改進與探討[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2001,17(2):198-200.

[4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[5]Katherine L,Possin J,Vincent F,et al.Spatial and object working memory deficits in Parkinson's disease are due to impairment in different underlying processes[J].Neuropsychology,2008,22(5):585-595.

[6]何婧,陳海波.帕金森病患者的視空間功能障礙研究[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2013,20(1):48-51.

[7]姜紅,劉獻增,董建強,等.海馬局部注射人骨髓間充質(zhì)干細胞對癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠視空間記憶的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué),2008,11(6A):943-945.

[8]王光勝,耿德勤.腦缺血/再灌注損傷機制研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(24):3753-3756.

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