抗水通道蛋白4抗體診斷視神經(jīng)脊髓炎的臨床價值

蘇國華，馮麗萍，劉立海（河北省滄州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 061000）

視神經(jīng)脊髓炎是一種炎性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘神經(jīng)疾病，主要影響人體的視神經(jīng)和脊髓，臨床表現(xiàn)為選擇性的累及人體神經(jīng)和脊髓，誘發(fā)脊髓炎或視神經(jīng)炎，其病理改變的關(guān)鍵在于脫髓鞘、硬化斑、壞死空洞的形成，并伴隨血管周圍炎性細胞浸潤［1］。近年來，隨著大量臨床研究的問世，視神經(jīng)脊髓炎的免疫機制也逐漸確定，基本認為該病是一種選擇性、侵襲性損傷視神經(jīng)和脊髓的自身免疫性疾病［2］。本研究通過檢查視神經(jīng)脊髓炎患者的空腹抗水通道蛋白4抗體（抗AQP4抗體）水平，探討神經(jīng)脊髓型多發(fā)性硬化疾病中抗AQP4抗體的敏感性，并進一步研究抗AQP4抗體在神經(jīng)脊髓炎臨床診斷中的應(yīng)用價值?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2014年1月本院視神經(jīng)脊髓炎患者100例，其中男10例，女90例。經(jīng)倫理委員會審核批準，在事先征得患者同意的條件下，取100例視神經(jīng)脊髓炎患者的血清標本進行臨床檢驗，入選100例患者在不考慮抗AQP4抗體陽性的基礎(chǔ)上按照2006年視神經(jīng)脊髓炎的診斷標準進行臨床診斷。

1.2 儀器與試劑間接免疫熒光檢測法試劑選擇F12coon′s、胎牛血清、LipofectamineTM2000、牛血清清蛋白（BSA）、兔抗人AQP4抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗人和羊抗兔IgG二抗、Cy3標記羊抗人IgG 二抗、瓊脂糖等。

1.3 檢測方法所有患者血清中AQP4抗體水平的檢測均采用人AQP4轉(zhuǎn)染細胞間接免疫熒光法，于轉(zhuǎn)染前1d將FRT細胞（37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)）應(yīng)用0.25%的胰酶予以消化，在60%～80%的合適密度下將培養(yǎng)處理后的細胞接種于12孔板中；根據(jù)LipofectamineTM2000的說明書上的操作流程，將人AQP4質(zhì)粒導(dǎo)入至FRT 細胞中，并于細胞轉(zhuǎn)染后45h使用磷酸鹽緩沖液（PBS）（含有4%多聚甲醛）進行固定，經(jīng)0.1%聚氧乙烯辛基苯及醚磷酸鹽緩沖液（Triton X－100PBS）通透后，應(yīng)用PBS（含有2%的BSA）封閉液予以室溫封閉；隨后加入視神經(jīng)脊髓炎患者血清，在4℃下孵育12h，用PBS清洗3遍，加入Cy3標記羊抗人IgG 二抗中和后使用PBS洗掉非特異性結(jié)合抗體，最后奧林巴斯BX60熒光顯微鏡下觀察并攝取影像資料［3］。研究過程中陽性標本滴度的確定以1∶1000作為陽性滴度最大值，以64×為界值作為最小陽性滴度［3］。

2 結(jié)果

按照研究界定標準，100例視神經(jīng)脊髓炎患者中53例為陽性。在分別轉(zhuǎn)染至pcDNA3.1及pcDNA3.1－h(huán)AQP4質(zhì)粒的FRT 細胞上視神經(jīng)脊髓炎患者血清免疫染色結(jié)果提示：（1）轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒FRT 細胞中并不存在特異性染色；（2）轉(zhuǎn)染AQP4基因FRT 細胞中存在明顯細胞膜染色；（3）水通道蛋白AQP4在細胞膜上的表達說明視神經(jīng)脊髓炎患者血清中抗體有極大可能識別水通道蛋白AQP4。利用表達人AQP4抗體的FRT細胞通過高特異性的AQP4抗體陽性作為對照，檢測視神經(jīng)脊髓炎患者血清中含有的抗體識別靶蛋白，研究結(jié)果表明，AQP4抗體與視神經(jīng)脊髓炎血清識別靶抗原為同種蛋白，即AQP4蛋白?？笰QP4抗體針對男性以及女性患者陽性率的比較情況，見表1。

表1 抗AQP4抗體在男性及女性患者陽性率的比較

3 討論

臨床上將視神經(jīng)脊髓炎稱為Devic病、Devic綜合征等，其他亞洲國家稱其為視神經(jīng)脊髓炎型多發(fā)性硬化，屬于先后或同時累及視神經(jīng)及脊髓的急性或亞急性脫髓鞘疾病［4］。本研究主要探討抗AQP4抗體在視神經(jīng)脊髓炎患者血清中的表達，以及抗AQP4抗體在視神經(jīng)脊髓炎臨床診斷中的應(yīng)用價值。作為水通道中在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達最為豐富的成員，抗AQP4抗體參與了視神經(jīng)脊髓炎、腦水腫等多種常見臨床疾病的發(fā)病過程［4］。大量臨床研究表明，抗AQP4抗體在大鼠腦中主要表達于星形膠質(zhì)細胞及室管膜細胞當(dāng)中，在與毛細血管及軟腦膜直接相連接的膠質(zhì)細胞表達十分豐富［5］。自從臨床研究確認視神經(jīng)脊髓炎－IgG 靶抗原為AQP4抗體以來，臨床對于視神經(jīng)脊髓炎這一疾病檢測的靈敏度與特異性有了較為顯著的提高，但AQP4抗體的特異性在視神經(jīng)脊髓炎發(fā)病期間的確切作用臨床上尚無明確解釋［5］。

在許多臨床研究中，AQP4抗體的特異性和高靈敏度均有助于視神經(jīng)脊髓炎的臨床診斷，本組研究顯示100例視神經(jīng)脊髓炎患者血清中自身免疫性抗體靶抗原為水通道AQP4抗體，進一步證實了AQP4抗體在視神經(jīng)脊髓炎生理及病理過程中的重要作用。目前AQP4抗體已經(jīng)成為視神經(jīng)脊髓炎臨床診斷標準中所包含的一項指標，并且AQP4抗體也是其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病鑒別的重要實驗室指標［6］。盡管AQP4抗體已經(jīng)作為視神經(jīng)脊髓炎臨床診斷中一項必要的支持條件，但該診斷標準是建立在臨床以及磁共振成像（MRI）檢查的基礎(chǔ)上的，AQP4抗體作為視神經(jīng)脊髓炎疾病的一項支持診斷條件，能夠明顯提升診斷視神經(jīng)脊髓炎的特異性。此外，尤為重要的是在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中，如臨床尚不滿足于MRI診斷，AQP4抗體則是唯一具有高特異性的能夠鑒別視神經(jīng)脊髓炎的診斷指標［6］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，抗AQP4針對男性患者表現(xiàn)的陽性率為20.00%，針對女性患者的陽性率為72.22%，女性患者的陽性率明顯高于男性患者（P＜0.05）。視神經(jīng)脊髓炎在東西方的臨床診斷中存在一定爭論，日本一般將此類患者鑒別為多發(fā)性硬化，而歐美國家通常將此類患者診斷為視神經(jīng)脊髓炎［7］；本研究用于檢測AQP4抗體在視神經(jīng)脊髓炎患者血清中高表達的實驗室方法是目前國內(nèi)最敏感的AQP4抗體檢測法。與AQP4抗體陽性相關(guān)的一些臨床表型，如不滿足視神經(jīng)脊髓發(fā)展成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的常規(guī)診斷標準，這更加證實了AQP4抗體在視神經(jīng)脊髓炎臨床診斷鑒別中的價值及其在免疫性疾病特異性標記物和預(yù)測預(yù)后方面的臨床價值。一般來說，AQP4抗體血清陽性患者的疾病有進一步發(fā)展或致殘的危險性。因此，作者提倡檢測視神經(jīng)脊髓炎患者血清中的AQP4抗體表達，并且對于AQP4抗體陽性患者應(yīng)給予免疫抑制劑治療，以有效控制疾病的發(fā)展。

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