重組分泌型人類免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)及活性檢測(cè)＊

韋紅玉，曾怡，唐華英，趙麗娟（右江民族醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西百色 533000）

人類免疫缺陷病毒1型（HIV－1）感染細(xì)胞可釋放大量的可溶性蛋白，其中包括Tat蛋白。Tat蛋白是HIV－1病毒復(fù)制所必需的反式激活因子，但Tat蛋白沒(méi)有分泌信號(hào)，只是當(dāng)T細(xì)胞急性感染HIV－1時(shí)，Tat蛋白可被釋放到細(xì)胞外間質(zhì)，并可作用于其他細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)感染的其他病毒，發(fā)揮細(xì)胞轉(zhuǎn)化或激活病毒復(fù)制周期的作用。已有研究證實(shí)Tat蛋白與HIV－1 RNA 5′端啟動(dòng)子上的反式激活反應(yīng)元件（TAR）結(jié)合，激活HIV－1長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）使其下游的基因得以表達(dá)，從而促進(jìn)整個(gè)HIV－1轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)［1］。研究表明Tat蛋白可激活人類皰疹病毒6型、8型，也可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和艾滋?。ˋIDS）相關(guān)的卡波濟(jì)肉瘤（KS）細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、分化及黏附等。

為研究細(xì)胞外Tat蛋白對(duì)其他病毒復(fù)制周期的影響，本研究在構(gòu)建了重組HIV－1tat基因的分泌型真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，對(duì)Tat蛋白的表達(dá)及生物活性進(jìn)行了檢測(cè)，為進(jìn)一步研究Tat蛋白的生物學(xué)作用，探索細(xì)胞外Tat蛋白對(duì)正常細(xì)胞或其他細(xì)胞內(nèi)潛伏感染病毒的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞 pcDNA3.1（＋）／Tat質(zhì)粒在tat基因末端加入Linker序列GGAGGC，并融合Flag序列GACTACAAGGACGACGATGACAAG，以便利用抗Flag標(biāo)簽抗體檢測(cè)Tat蛋白的表達(dá)。BCBL－1細(xì)胞為人類皰疹病毒8型感染、EB病毒陰性的體腔滲出性淋巴瘤細(xì)胞系，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃培養(yǎng)。人胚腎上皮細(xì)胞293細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃培養(yǎng)。pcDNA3.1（＋）／Tat質(zhì)粒、LTR－CAT 質(zhì)粒、BCBL－1細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)盧春教授饋贈(zèng)。293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。

1.1.2 試劑與儀器參考文獻(xiàn)［2］設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物，并在PCR 上游引物的5′端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)，下游引物的5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，為增強(qiáng)其表達(dá)，在上游引物5′端起始密碼子ATG 前添加了KOZAK 序列（GCCACC）以增強(qiáng)基因的表達(dá)，同時(shí)為便于Tat蛋白的檢測(cè)，原質(zhì)粒中tat基因下游融合的Flag序列一并擴(kuò)增。上游引物序列（方框內(nèi)為KOZAK 序列，劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）P15′－taa tgccat gag ttc cac ac－3′，下游引物序列（劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）gca g－3′；預(yù)期片段大小為807bp。同時(shí)設(shè)計(jì)另一對(duì)引物，上游引物5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，P35′－taacac cat gag ttc cac ac－3′，下游引物5′端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)，P45′－gga caa gct tga tga aca gta gca gca g－3′，此對(duì)引物擴(kuò)增獲得的反向序列同時(shí)構(gòu)建重組分泌型載體，作為重組對(duì)照質(zhì)粒。PCR 引物均由上海英駿生物工程公司合成。Lammda DNA EcoRⅠ＋HindⅢ分子量標(biāo)記、100bp ladder plus DNA 分子量標(biāo)記、PCR 所用試劑Taq DNA 多聚酶及緩沖液、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、小牛堿性磷酸酶購(gòu)自Fermentas公司，感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京天根生化科技公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司。Western blot所用試劑anti－Flag、anti－βactin、HRP－羊抗兔抗體、ECL發(fā)光試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均購(gòu)自Amresco。研究中主要使用下列儀器：1－15PK 冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma）、Mycycler PCR 儀（美國(guó)Bio－Rad）、垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad）、Chemidoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad）。

1.2 方法

1.2.1 HIV－1tat基因的擴(kuò)增及純化取pcDNA3.1（＋）／Tat質(zhì)粒做模板，用PCR 引物擴(kuò)增HIV－1tat基因，PCR 反應(yīng)體系包括：上游引物10pmol；下游引物10pmol；10×Taq DNA 聚合酶緩沖液5μL；MgCl 2.5mmol／L；dNTPs每種2.5 mmol／L；Taq DNA 聚合酶2單位；總反應(yīng)體積50μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5 min；按94℃1 min，59℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。取5μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察確認(rèn)擴(kuò)增成功。平衡酚：氯仿法純化剩余的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及tat基因插入方向的鑒定分別取1μg PCR 產(chǎn)物和1μg pSecTag2B，經(jīng)HindⅢ酶切，10g／L瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收DNA 片段。T4DNA 連接酶16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布含100μg／mL氨芐西林（Ampicillin，Amp）的LB平板，37℃培養(yǎng)16～18h。挑取5個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆至含100μg／mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃250r／min 振蕩培養(yǎng)16～18h。提取質(zhì)粒，HindⅢ與BamHⅠ酶切初步鑒定。經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ酶切初步鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒，送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定。確定tat基因正向插入克隆（命名為pSecTat）和tat基因反向插入克?。麨閜SecTat－AS）。

1.2.3 Western blot檢測(cè)tat基因重組質(zhì)粒在293細(xì)胞中的表達(dá)及其分泌表達(dá)采用Invitrogen 公司生產(chǎn)的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。將pSecTat轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，培養(yǎng)于六孔板，于轉(zhuǎn)染后24、48h收集293細(xì)胞，Western blot檢測(cè)真核細(xì)胞內(nèi)Tat蛋白表達(dá)；用1×SDS凝膠上樣緩沖液裂解細(xì)胞，煮沸變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），并轉(zhuǎn)移PVDF 膜。分別以anti－Flag、anti－βactin 為一抗、HRP－羊抗兔抗體為二抗，Western blot檢測(cè)Tat蛋白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑ECL檢測(cè)，最后用柯達(dá)X 線片感光。

1.2.4 CAT－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組Tat蛋白的調(diào)控活性將pSecTat與LTR－CAT 質(zhì)粒（質(zhì)粒中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT 由HIV LTR 啟動(dòng)，LTR 激活則CAT 表達(dá)）共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和BCBL－1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h，收集細(xì)胞，按CAT－ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)CAT 表達(dá)水平；從而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Tat蛋白的調(diào)控活性，同時(shí)以Tat基因反向重組質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。

1.2.5 CAT－ELISA 檢測(cè)表達(dá)分泌至細(xì)胞外表達(dá)的重組Tat蛋白的調(diào)控活性將pSecTat轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，培養(yǎng)于Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)上層，將LTR－CAT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BCBL－1細(xì)胞，培養(yǎng)于Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)下層，采用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)pSecTat轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞后分泌Tat蛋白及其胞外調(diào)控活性，分別于轉(zhuǎn)染后6、24、48、72h收集BCBL－1細(xì)胞；另采用同樣方法檢測(cè)pSecTat在腎系膜細(xì)胞中的分泌表達(dá)及其對(duì)BCBL－1細(xì)胞內(nèi)LTR－CAT 的調(diào)控活性。收集的細(xì)胞按CAT－ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)CAT 表達(dá)水平；同時(shí)以Tat基因反向重組質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 HIV－1tat基因的擴(kuò)增用引入限制性酶切位點(diǎn)的PCR引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增并用10g／L 瓊脂糖凝膠電泳后，在300bp附近出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的324bp大小相符。見(jiàn)圖1。

2.2 tat重組分泌型真核表達(dá)載體的鑒定挑取正向和反向陽(yáng)性克隆各2個(gè)提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindⅢ與BanHⅠ酶切，并用10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，共有2個(gè)正向克隆和1個(gè)反向克隆在約330bp和約5200bp位置出現(xiàn)條帶，其中1個(gè)反向克隆未見(jiàn)目的條帶，見(jiàn)圖2。將2個(gè)正向克隆質(zhì)粒和1個(gè)反向克隆質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序，結(jié)果顯示克隆的tat基因序列與GenBank中登記的HIV－1tat基因100%同源。

圖1 PCR 擴(kuò)增HIV－1tat基因

圖2 tat重組分泌型真核表達(dá)載體的酶切鑒定

2.3 Western blot檢測(cè)tat基因重組質(zhì)粒在293細(xì)胞中的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，pSecTat在能在293細(xì)胞中表達(dá)，用anti－Flag抗體可檢測(cè)到約20×103的條帶，與預(yù)期的Tat蛋白的19×103分子量大小一致，而反向插入tat基因的對(duì)照質(zhì)粒pSecTat－antise轉(zhuǎn)染293細(xì)胞則檢測(cè)不到該條帶（圖3）。

圖3 重組Tat蛋白的Western blot檢測(cè)

2.4 CAT－ELISA 檢測(cè)重組Tat蛋白在293細(xì)胞中的活性pSecTat與LTR－CAT 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后24、48h，CATELISA 檢測(cè)293細(xì)胞內(nèi)CAT 的表達(dá)水平（圖4）。結(jié)果顯示，與pSecTat－AS對(duì)照質(zhì)粒相比，pSecTat可刺激CAT 表達(dá)（P＜0.05），并隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加，CAT 表達(dá)增加。

圖4 CAT－ELISA 檢測(cè)重組Tat蛋白在293細(xì)胞中的活性

2.5 重組Tat蛋白在293細(xì)胞、BCBL－1細(xì)胞中的活性比較pSecTat與LTR－CAT 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞、BCBL－1細(xì)胞后48h，CAT－ELISA 檢測(cè)293細(xì)胞、BCBL－1細(xì)胞內(nèi)CAT 的表達(dá)水平（圖5）。結(jié)果顯示，與pSecTat－AS對(duì)照質(zhì)粒相比，pSecTat在293細(xì)胞及BCBL－1細(xì)胞中均可表達(dá)，但在293細(xì)胞中的表達(dá)效率高于在BCBL－1細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.05）。

圖5 重組Tat蛋白在293細(xì)胞、BCBL－1細(xì)胞中的活性比較

2.6 重組分泌型Tat蛋白的細(xì)胞外活性檢測(cè)采用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染pSecTat的293細(xì)胞與轉(zhuǎn)染LTRCAT 的BCBL－1細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)BCBL－1細(xì)胞中CAT 表達(dá)水平，判斷pSecTat在293細(xì)胞中表達(dá)后分泌至細(xì)胞外的Tat蛋白的活性能否刺激BCBL－1細(xì)胞內(nèi)CAT 表達(dá)。結(jié)果顯示，與pSecTat－AS對(duì)照相比，pSecTat轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞可使BCBL－1細(xì)胞中CAT 蛋白表達(dá)顯著。但轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)至72h時(shí)，分泌型Tat已無(wú)活性（圖6）。

圖6 CAT－ELISA 檢測(cè)重組分泌型Tat蛋白的細(xì)胞外調(diào)控活性

3 討論

HIV－1反式轉(zhuǎn)錄激活因子（Tat）是HIV－1長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）轉(zhuǎn)錄起始和病毒增殖所必需的調(diào)節(jié)蛋白，含86～101個(gè)氨基酸［3－4］。除了在病毒基因表達(dá)中的轉(zhuǎn)錄激活作用之外，Tat蛋白還可從HIV－1感染的完整細(xì)胞內(nèi)釋放至細(xì)胞外，并保持活性。在HIV－1感染者血清中或體外培養(yǎng)細(xì)胞上清液中的Tat蛋白濃度可達(dá)40ng／mL［5－6］。這種外源的Tat蛋白可進(jìn)入HIV－1未感染細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或進(jìn)入潛伏感染細(xì)胞激活病毒基因組轉(zhuǎn)錄。Tat蛋白在HIV－1的致病機(jī)制中不僅是HIV－1復(fù)制所必需的蛋白，還發(fā)揮了細(xì)胞外毒素的作用。

本研究采用PCR 從pcDNA3.1（＋）／Tat質(zhì)粒中擴(kuò)增融合Flag標(biāo)簽的tat全基因，利用HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，將其正向克隆入分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B 中，同時(shí)構(gòu)建反向克隆作為對(duì)照。進(jìn)行基因測(cè)序確定基因的序列和克隆方向后，進(jìn)一步利用抗Flag抗體，通過(guò)Western blot檢測(cè)到Tat－Flag融合蛋白在293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。本研究還通過(guò)pSecTat與LTR－CAT 共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞、pSecTat與LTR－CAT 分別轉(zhuǎn)染Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)中上下層的細(xì)胞，進(jìn)一步確認(rèn)表達(dá)的Tat－Flag融合蛋白不但在293細(xì)胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄激活活性，還可分泌至細(xì)胞外，并進(jìn)入BCBL－1細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)的LTR－CAT 報(bào)告質(zhì)粒表達(dá)CAT。結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體，該載體不僅可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有轉(zhuǎn)錄激活活性的Tat－Flag蛋白，該融合蛋白還可分泌至細(xì)胞外，通過(guò)旁分泌作用，發(fā)揮其生物學(xué)活性。

在美國(guó)，有超過(guò)20%的AIDS患者同時(shí)患有KS，這類KS稱為AIDS－KS。多項(xiàng)研究表明，卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）的感染與KS的發(fā)生密切相關(guān)，而HIV－1感染者更容易發(fā)生KS。本課題組先前的研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Tat蛋白可激活潛伏的KSHV 的復(fù)制周期，并促進(jìn)Kaposin蛋白介導(dǎo)的類KS腫瘤形成［7－8］。本研究在檢測(cè)重組Tat蛋白的分泌活性時(shí)，檢測(cè)了293細(xì)胞分泌的Tat蛋白對(duì)KSHV 感染細(xì)胞BCBL－1細(xì)胞內(nèi)LTR－CAT 質(zhì)粒的調(diào)控，結(jié)果證實(shí)分泌型的Tat蛋白可以進(jìn)入BCBL－1細(xì)胞，并誘導(dǎo)LTR－CAT 質(zhì)粒中的CAT 表達(dá)。表明分泌型Tat蛋白具有穿入BCBL－1細(xì)胞的能力，并具有轉(zhuǎn)錄激活活性。本研究使用的BCBL－1細(xì)胞是KSHV 潛伏感染細(xì)胞系，構(gòu)建重組tat基因分泌型載體對(duì)研究Tat蛋白在AIDS－KS發(fā)生機(jī)制中的作用有重要意義。

［1］Barillari G，Ensoli B.Angiogenic effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1Tat protein and its role in the pathogenesis of AIDS－associated Kaposi＇s sarcoma［J］.Clin Microbiol Rev，2002，15（2）：310－326.

［2］盧春，錢(qián)超，唐桂霞，等.含HIV－1Tat基因重組反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)Tat蛋白功能檢測(cè)［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：英文版，2003，17（6）：261－269.

［3］Jeang KT，Xiao H，Rich EA.Multifaceted activities of the HIV－1transactivator of transcription，Tat［J］.J Biol Chem，1999，274（41）：28837－28840.

［4］Fujisawa J，Seiki M，Kiyokawa T，et al.Functional activation of the long terminal repeat of human T－cell leukemia virus type I by a trans－acting factor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1985，82（8）：2277－2281.

［5］Ensoli B，Barillari G，Salahuddin SZ，et al.Tat protein of HIV－1stimulates growth of cells derived from Kaposi＇s sarcoma lesions of AIDS patients［J］.Nature，1990，345（6270）：84－86.

［6］Xiao H，Neuveut C，Tiffany HL，et al.Selective CXCR4 antagonism by Tat：implications for in vivo expansion of coreceptor use by HIV－1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（21）：11466－11471.

［7］Zeng Y，Zhang X，Huang Z，et al.Intracellular tat of human immunodeficiency virus type 1activates lytic cycle replication of kaposi＇s sarcoma－associated herpesvirus：role of JAK／STAT signaling［J］.J Virol，2007，81（5）：2401－2417.

［8］Chen X，Cheng L，Jia X，et al.Human immunodeficiency virus type 1 Tat accelerates Kaposi sarcoma－associated herpesvirus Kaposin A－mediated tumorigenesis of transformed fibroblasts in vitro as well as in nude and immunocompetent mice［J］.Neoplasia，2009，11（12）：1272－1284.