附麻平喘方對哮喘模型大鼠的作用與機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

邢亞群 王迪生 龍子江

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，蚌埠，233000;2安徽省合肥市安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)教研室，合肥，230038)

哮喘是支氣管哮喘的簡稱，該證是由肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞參與的慢性持續(xù)性氣道炎性反應(yīng)性疾病，屬于Ⅰ型超敏反應(yīng)，臨床上以痰、咳、喘為其主癥。目前西醫(yī)臨床采取抗炎解痙為主的治療原則，使用β－受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、茶堿等藥物治療取得了一定的療效，但不良反應(yīng)大，遠(yuǎn)期療效不很理想。中醫(yī)治療該證有長期的臨床經(jīng)驗(yàn)，附麻平喘方是臨床經(jīng)驗(yàn)方，本實(shí)驗(yàn)通過觀察該方對實(shí)驗(yàn)大鼠血漿IL－4、IFN－γ、IgE，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，血清皮質(zhì)酮(CORT)等改變，探討該方對哮喘大鼠的治療功效與作用機(jī)制[3－7]。

中醫(yī)學(xué)將該病歸于“哮”證和“喘”證的范疇，臟腑功能失調(diào)或虛弱等均可引起痰鳴氣喘等證。在臨床上有眾多的證型分類，有的以病性分型，如冷哮(寒哮)、熱哮、虛哮;有以病因分型，如風(fēng)哮、痰哮;有的按發(fā)作期、緩解期分類，且以虛實(shí)為綱[8]。盡管分型眾多，但它的治療離不開肺與腎，特別是久咳久喘或腎虛性患者。故重視標(biāo)本兼治也已成為治療這類哮喘患者的一條重要治則。附麻平喘方根據(jù)這一治則合理組方，用于治療支氣管哮喘。

1 材料與方法

1.1 藥物 試驗(yàn)藥物為附麻平喘方，該藥由下列中藥顆粒劑(江陰天江藥業(yè)生產(chǎn))組成:附子10 g(批號:120518)、麻黃 10 g(批號:120606)、桂枝10 g(批號:120810)、細(xì)辛 3 g(批號:120703)、青皮 10 g(批號:130219)、甘草5 g(批號:121007)、決明子10 g(批號:120613)、白芍15 g(批號:120308)、熟地黃20 g(批號:130128)、紫菀10 g(批號:121105)、蘇子10 g(批號:130307)、淫羊藿15 g(批號:120627)、巴戟天10 g(批號:120908)等中藥組成。上述中藥飲片按中藥常規(guī)方法煎煮3次，合并藥液，制成濃度為5 g/mL的水煎液，所給劑量按人與動物的劑量換算所得，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整。陽性對照藥為補(bǔ)腎防喘片(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn)，批號11120008)，臨用時(shí)配成相應(yīng)濃度使用。

1.2 動物 未曾交配的4～5月齡SPF級SD大鼠60只，均為雄性，體重(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物合格證書號:SCXK(皖)2011－002。室溫22～25℃、相對濕度為40% ～50%，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝水。

1.3 主要試劑 氫氧化鋁(江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號:20120909);卵清蛋白(Sigma公司分裝);甲醛(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，批號:20121110);生理鹽水(開開援生制藥股份有限公司，批號:2092864);水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號:20110304)，磷酸鹽緩沖液，(萬新試劑，批號:1112130101);ACTH ELISA試劑盒、CORT ELISA試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號分別為:10805R，10332R)，β–腎上腺素受體試劑盒(北京博奧森，批號:998825006W)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 漩渦混合器，其林貝爾儀器制造公司，型號:GL－88B;超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，批號:1203001);ALC210型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);酶標(biāo)儀，雷杜，型號:RT－6000;離心機(jī):安徽嘉文，型號:JW3021HR;電熱恒溫箱:上海三發(fā)，型號:DNP－9052BS－Ⅲ;分析天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;移液器，eppendorf;電爐(上海日用電爐廠);電子天平(上海天平儀器廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 動物分組及給藥:取雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常組外，其他大鼠分別于第1、7天腹腔注射10%卵清白蛋白(OVA)混懸液1 mL(含OVA 100 mg+氫氧化鋁100 mg)。正常組注射生理鹽水 1 mL，各組完成致敏階段[5，9－10]。然后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組。正常對照組(等容量的蒸餾水)、哮喘模型組(等容量的蒸餾水)、陽性藥物組(377.5 mg/kg)，附麻平喘方高劑量組(49.68 g/kg)，附麻平喘方中劑量組(24.84 g/kg)及附麻平喘方低劑量組(12.42 g/kg)，每組各10只。第15天起模型組與各給藥組分別放于5 L自制玻璃霧化箱內(nèi)，第1、2周以1%OVA進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，1次/d，20 min/次，每2周濃度提高0.5%，共霧化8周，正常組則霧化生理鹽水替代OVA。給藥容積為1 mL/100 g體重。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 血清 IL－4，IFN－γ，IgE的檢測 末次給藥后，禁食24 h，不限水，用3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈抽血后處死。分離取血清及血漿，血清用于IL－4，IFN－γ，IgE的檢測。該檢測采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)。

1.6.2 血清CORT和血漿ACTH的檢測 末次給藥后，禁食24 h，不限水，用3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈抽血后處死。分離取血清及血漿，血清用于CORT含量檢測，血漿用于ACTH含量檢測。

1.6.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)檢測 取肺臟稱重，用10%甲醛固定后，以備HE染色觀察肺組織病理變化。

1.6.4 肺組織β－AR的檢測 取另一側(cè)肺臟，采用免疫組化法檢測肺組織β–AR的含量。計(jì)算公式:免疫組織化學(xué)指數(shù)=GR表達(dá)陽性面積×平均光密度值。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以(±s)表示，定量資料每組實(shí)驗(yàn)前后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用方差分析(方差齊的采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnettt檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型大鼠病理形態(tài)學(xué)的觀察 正常組大鼠肺無實(shí)質(zhì)性異常炎性反應(yīng)改變，氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠氣道和支氣管壁周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌層肥大、增生，黏膜充血、水腫，氣道腔內(nèi)上皮脫落、受損，管腔內(nèi)充滿大量的黏性分泌物，肺泡結(jié)構(gòu)亦出現(xiàn)紊亂、融合現(xiàn)象。補(bǔ)腎防喘片組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較好，與正常對照組相似，支氣管上皮結(jié)構(gòu)較完整，氣道平滑肌層稍增生，腔內(nèi)無明顯分泌物，支氣管及肺泡炎性細(xì)胞浸潤亦輕于模型組。附麻平喘方高，中劑量組的肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血程度較模型組減輕，支氣管上皮結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)無明顯分泌物，肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺泡腔內(nèi)無明顯炎性物質(zhì)滲出。附麻平喘方低劑量組支氣管周圍有較多的炎性細(xì)胞，支氣管平滑肌增生強(qiáng)于高，中劑量組，肺泡有融合現(xiàn)象，結(jié)果見圖1。

圖1 HE染色檢測哮喘大鼠肺組織病理學(xué)變化×200

2.2 附麻平喘方對哮喘模型大鼠CORT和ACTH的影響 與正常對照組比較，模型組ACTH，CORT值明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性組CORT(P＜0.01)和 ACTH(P＜0.05)升高，高劑量組 CORT，ACTH值升高(P＜0.05)，中劑量組和低劑量組CORT和ACTH值升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 附麻平喘方對CORT，ACTH水平的影響(±s，n=10)

表1 附麻平喘方對CORT，ACTH水平的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 CORT(ng/mL) ACTH(pg/mL)正常組 343.16±48.41＊＊ 129.80±22.90＊＊模型組 261.69±34.92 70.47±16.66補(bǔ)腎防喘片組 342.46±41.25＊＊ 102.69±12.94*附麻平喘方高劑量組 304.81±63.65* 95.79±25.40*附麻平喘方中劑量組 342.47±49.84＊＊ 110.03±30.98＊＊附麻平喘方低劑量組 353.75±36.21＊＊ 104.46±28.00＊＊

2.3 附麻平喘方對哮喘模型大鼠肺組織β－AR免疫組化指數(shù)的影響 與正常對照組比較，模型組β－AR明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，陽性組β－AR升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);附麻平喘方高、中劑量組β－AR升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);低劑量組β－AR升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.4 附麻平喘方對哮喘模型大鼠IL－4，IFN－γ，IgE的影響 與正常對照組比較，模型組IL－4，IgE值升高，IFN－γ值降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性組，中劑量組和低劑量組IL－4值降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);陽性組，中劑量和低劑量組IFN－γ值升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);陽性組IgE值降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高劑量組和中劑量組降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表2 附麻平喘方對β–AR免疫組化指數(shù)影響(±s，n=10)

表2 附麻平喘方對β–AR免疫組化指數(shù)影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg) β－AR正常組——205.61±25.45＊＊模型組——60.30±9.87補(bǔ)腎防喘片組 0.38 128.82±19.03＊＊附麻平喘方高劑量組 49.68 156.48±13.14＊＊附麻平喘方中劑量組 24.84 105.56±21.82＊＊附麻平喘方低劑量組 12.42 90.74±10.66*

表3 附麻平喘方對IL－4，IFN－γ水平的影響(±s，n=10)

表3 附麻平喘方對IL－4，IFN－γ水平的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

＊＊正常組 89.21±11.24＊＊ 194.95±29.45＊＊ 16.94±3.45模型組 128.02±24.41 136.22±27.33 21.85±3.49補(bǔ)腎防喘片組 93.21±13.32＊＊ 165.23±27.09* 17.03±3.39＊＊高劑量組 107.29±24.22* 146.26±28.55 17.48±2.93*中劑量組 93.17±26.56＊＊ 182.19±26.91＊＊ 17.88±1.76*低劑量組 104.72±20.66* 168.00±29.65*19.11±2.67

此外，模型組大鼠與正常對照組相比在“望診”方面出現(xiàn)了皮毛無澤、豎立，大小便量增多，身體消瘦，動作遲鈍，精神不振，蜷臥等癥狀，同時(shí)伴見呼吸急促，喘息，哮鳴音，口鼻四肢發(fā)紺，嚴(yán)重者，甚至出現(xiàn)了明顯的喘促聲或打噴嚏、搔鼻、咳嗽等現(xiàn)象，提示該組大鼠出現(xiàn)了哮喘的癥狀，各給藥組上述癥狀均不同程度減輕、好轉(zhuǎn)。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘的病理生理變化涉及到免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)多個(gè)環(huán)節(jié)，其中下丘腦－垂體前葉－腎上腺皮質(zhì)與單核－巨噬細(xì)胞環(huán)路是目前與哮喘等應(yīng)激有關(guān)的研究較多的一個(gè)環(huán)路，即HPA(下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì))軸。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者HPA(下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì))軸功能低下[9]，特別是糖皮質(zhì)激素水平較低。

哮喘是以肥大細(xì)胞反應(yīng)，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的慢性氣道炎性反應(yīng)性疾病;T淋巴細(xì)胞的2種亞型Th1、Th2的失衡與哮喘的發(fā)作密切相關(guān)，Th2細(xì)胞過度表達(dá)可導(dǎo)致哮喘發(fā)作，因此Th1、Th2的比值也成為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究判定治療結(jié)果的指標(biāo)之一[10];IFN－γ、IL－4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子[11]。哮喘患者Th1細(xì)胞功能下降，Th2細(xì)胞功能異常增高，以致IFN－γ分泌減少，IL－4分泌增多，因此IFN－γ在相關(guān)研究中作判定治療結(jié)果的指標(biāo)之一[12]。它們作為一種重要的趨化因子，對引起哮喘發(fā)作的各種效應(yīng)細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T細(xì)胞及IgE均有較強(qiáng)的趨化作用，可趨化嗜酸性粒細(xì)胞向氣道聚集后，嗜酸性粒細(xì)胞可釋放炎性遞質(zhì)白三烯、血小板活化因子等，造成氣道細(xì)胞組織的炎性損傷，又直接導(dǎo)致氣道痙攣，并最終可導(dǎo)致氣道反應(yīng)性的增高。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也與上述哮喘機(jī)制相吻合:模型組ACTH和CORT主要的檢測指標(biāo)明顯偏低，附麻平喘中劑量組的ACTH和CORT指標(biāo)高于模型組，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果表明附麻平喘方通過附麻平喘方治療哮喘的作用機(jī)制與提高ACTH和CORT水平有關(guān)。

糖皮質(zhì)激素對哮喘發(fā)病機(jī)制的干預(yù)是通過抑制炎性反應(yīng)細(xì)胞的遷移和活化，抑制細(xì)胞因子的生成，抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)的釋放等實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與這一機(jī)制相吻合:模型組血清IFN－γ分泌減少，IgE、IL－4分泌增多;附麻平喘中、低劑量組IL－4、IL－8水平均低于模型組;其中、低劑量組IFN－γ水平均高于模型組、上述差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，哮喘患者氣道緊張度增高，β2受體功能相對降低，也是哮喘發(fā)病因素之一，糖皮質(zhì)激素水平升高可增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞β2受體的反應(yīng)性，有利于哮喘的緩解與減輕，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)了這一作用。

中醫(yī)學(xué)對哮喘癥的治療由來已久，既是在中西醫(yī)對照的情況下仍取得良好療效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為臟腑功能失調(diào)或虛弱，或因六邪七情、瘀血等致肺氣不宣，氣機(jī)上逆;或致濕濁內(nèi)生聚而生痰;或痰氣相搏，氣道攣急等均可引起痰鳴氣喘等證。在臨床上有眾多的證型分類，但肺主呼，腎主吸，與肺腎有密切關(guān)系，特別是久咳久喘患者精氣耗損，傷及元?dú)?，出現(xiàn)腎虛性癥狀。故重視補(bǔ)腎虛以治本[13]，宣降肺氣等以治標(biāo)，標(biāo)本兼治成為治療這類哮喘患者的一條重要治則。附麻平喘方根據(jù)這一治則合理組方，該方由補(bǔ)腎、調(diào)肺等中藥組成:附子、淫羊藿、巴戟天溫補(bǔ)腎陽為君藥;麻黃、桂枝、蘇子、細(xì)辛、紫菀、溫肺宣肺，通降肺氣，為臣藥;熟地黃陰中求陽，決明子瀉中求補(bǔ)，青皮疏肝理氣、調(diào)暢氣機(jī)，同為佐藥;甘草、白芍引經(jīng)、調(diào)和為使藥。上述君藥不僅能補(bǔ)益正氣，還有一定抗過敏作用[14]。

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