煎餅發(fā)酵面糊中乳酸菌的鑒定及保護劑配方的優(yōu)化

唐明禮，王勃，劉賀，何余堂，惠麗娟，馬濤

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州，121013)

煎餅的傳統(tǒng)生產(chǎn)主要利用面糊及環(huán)境中的乳酸菌和酵母菌自然發(fā)酵進行攤制，但生產(chǎn)過程易受微生物二次污染、食品質(zhì)量安全堪憂等問題將被發(fā)酵劑取代。乳酸菌廣泛應(yīng)用于發(fā)酵劑、益生菌、青貯飼料防腐劑等［1］。在煎餅的生產(chǎn)中乳酸菌有助于形成乳酸、乙醇、二氧化碳、芳香族化合物等化合物，有助于產(chǎn)品的風(fēng)味、香氣和口感，還能提高營養(yǎng)價值，對改善產(chǎn)品品質(zhì)與安全具有重要作用［2－4］。

真空冷凍干燥在低溫條件下利用升華作用去除水分，降低了化學(xué)反應(yīng)速率和減少了對生物結(jié)構(gòu)的破壞［5］。但凍干過程可導(dǎo)致冰晶、高滲環(huán)境的形成、細胞膜通透性的改變、敏感蛋白的變性與失活等，從而導(dǎo)致微生物的死亡，通過添加多糖、羥基化合物、蛋白質(zhì)、聚合物等保護劑能夠減低結(jié)晶率、提高最大凍結(jié)濃縮液和干物質(zhì)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度［6－9］，保證了凍干菌的存活率。

本文使用VITEC－2 compact微生物鑒定系統(tǒng)對煎餅發(fā)酵面糊中分離的乳酸菌進行鑒定，并制成直投式活菌發(fā)酵劑。為滿足產(chǎn)品質(zhì)量的要求，保證戊糖片球菌較高的存活率，本研究重點在于應(yīng)用響應(yīng)面分析方法對海藻糖、蔗糖、脫脂乳、L－谷氨酸鈉4種保護劑優(yōu)化戊糖片球菌在真空冷凍干燥過程的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:乳酸菌，實驗室分離保藏。

試劑:海藻糖 (分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;甘油 (食品級)，連云港友進食品添加劑技術(shù)開發(fā)有限公司;脫脂乳(食品級)，黑龍江完達山乳業(yè)股份有限公司;乳糖 (分析純)，天津市化學(xué)試劑工廠;葡萄糖(分析純)，天津市天利化學(xué)試劑有限公司;蔗糖(食品級)，龍舟南華糖業(yè)有限公司;L－谷氨酸鈉(分析純)，北京市朝陽區(qū)中聯(lián)化工試劑廠;MnSO4(分析純)，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;GP鑒定卡片，法國梅里埃。

MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;MRS肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEC－2 compact全自動微生物鑒定儀，法國梅里埃;FreeZone臺式真空冷凍干燥機，上海珂淮儀器有限公司;Biofuge Stratos高速冷凍離心機，美國THERMO;GMSX－280手提式壓力蒸汽滅菌器，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;HS－1300無菌操作臺，蘇州安泰;DHP－9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市鑫鑫試驗儀器廠;AR224CN電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司制造;MDF－382E(CN)超低溫冰箱，日本三洋。

1.3 實驗方法

1.3.1 VITEC－2 compact微生物鑒定儀對乳酸菌的鑒定

乳酸菌在－4℃的條件進行保藏，測試前將MRS固體培養(yǎng)基上的單菌落懸浮于0.45%的滅菌生理鹽水中，并用濁度儀確定濁度為0.5～0.63，將GP卡片插入此菌懸浮液中進行鑒定。GP卡片首先進入填充倉進行填充，使菌懸液進入卡片試劑中，填充完成將卡片放入切片分裝倉，儀器進行自動切片、封裝，將卡打入孵育倉，此后儀器每15 min自動讀卡檢測1次，檢測完畢后將自動打印報告單。

1.3.2 工藝流程

斜面菌株→活化→搖瓶擴大培養(yǎng)→離心濃縮→制備菌懸液→活菌計數(shù)→加入保護劑→預(yù)凍→真空冷凍干燥→產(chǎn)品→活菌計數(shù)

1.3.3 單一保護劑的制備與選擇

將表1中的保護劑按照相應(yīng)的濃度進行配制，在121℃，15 min的條件下滅菌備用。以生理鹽水為對照，測定凍干前后活菌數(shù)，計算存活率。

表1 保護劑的種類與用量Table 1 The type and amount of protective agent

1.3.4 菌體的培養(yǎng)與收集

將斜面上的菌株接至含有MRS肉湯的三角瓶中，36℃靜置培養(yǎng)12 h，將10 mL菌液加入到100 mL MRS肉湯中進行擴培，使培養(yǎng)液的菌數(shù)達到108/mL。將培養(yǎng)液以8 000 r/min、4℃的條件下離心10 min，棄去上清液，以一定量的無菌生理鹽水清洗菌泥。

1.3.5 真空冷凍干燥

在無菌的條件下，菌液與保護劑的比例為1∶1條件混合，保護劑與乳酸菌懸液平衡時間為30 min，－70℃預(yù)凍2 h，之后進行真空冷凍干燥。冷凍干燥參數(shù)為:22Pa、－50℃。

1.3.6 凍干前后活菌數(shù)的計算

將乳酸菌離心后的菌懸浮和凍干后的菌粉梯度稀釋，平板計數(shù)法計數(shù)，選擇菌落數(shù)30～300 CFU/mL的為有效稀釋倍數(shù)，記錄菌落數(shù)。

1.3.7 存活率的計算

實驗結(jié)果以存活率表示，分析真空冷凍干燥對乳酸菌的影響［10－11］。

式中，N:冷凍干燥后乳酸菌的數(shù)量;N0:冷凍干燥前乳酸菌的數(shù)量。

1.3.8 響應(yīng)面分析

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上，采用Box－Behnken實驗設(shè)計方案，以海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、脫脂乳為考察變量，分別以A、B、C表示，以存活率Y為響應(yīng)值，以+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，X為自變量的變化步長［12－15］。因子編碼及各自變量水平見表2。

表2 實驗因素水平及編碼Table 2 Code and level of factors chosen for the trials

2 結(jié)果與分析

2.1 VITEC-2 compact微生物鑒定儀對煎餅發(fā)酵面糊中乳酸菌的鑒定

使用濁度儀將乳酸菌的菌懸液濁度調(diào)為0.55，經(jīng)過5h的分析鑒定，鑒定結(jié)果為戊糖片球菌，可能性百分比為97%，具有良好的鑒定效果。

2.2 單一保護劑對戊糖片球菌存活率的影響

單一保護劑對戊糖片球菌存活率的影響見表3，蔗糖、海藻糖、脫脂乳、谷氨酸鈉對戊糖片球菌具有較好的保護效果，海藻糖對菌體的保護效果最好，對菌體的最大存活率可達65%。糖類對菌體的保護作用是凍干過程可取代水分子與磷脂雙分子層的極性基團形成氫鍵，防止了磷脂雙分子層的相變，保護了細胞膜的完整性［16］。脫脂乳對菌體的保護作用是脫脂乳中含有乳糖，乳中的膠體物質(zhì)也提高了玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，對微生物起到保護作用［17］。甘油通過與結(jié)合水發(fā)生水化作用，增加溶液的黏度，可防止冰晶的形成，故提高了戊糖片球菌在冷凍干燥過程中的存活率［18］。故選用谷氨酸鈉、蔗糖、海藻糖和脫脂乳4種保護劑進行復(fù)配實驗，以得到較好的存活率。

表3 單一保護劑對戊糖片球菌存活率的影響Table 3 The effect of a single protective agent on survival rate of Pediococcus pentosaceus

2.3 模型的建立及顯著性檢驗

表4列出戊糖片球菌凍干存活率的實測值及預(yù)測值，利用Design Expert軟件進行實驗設(shè)計并優(yōu)化出來的17組實驗以及結(jié)果見表4。

表4 實驗設(shè)計及其結(jié)果Table 4 Experimental designs and results

利用Design Expert(8.0.6)軟件對表4數(shù)據(jù)進行多元回歸方程擬合，得到海藻糖(X1)、谷氨酸鈉(X2)、蔗糖(X3)、脫脂乳(X4)的二次回歸方程為:Y=87.44+4.34X1+0.93X2+1.08X3+1.39X4+0.33X1X2+0.000X1X3+3.55X1X4+0.95X2X3－－4.75X42。并對該模型進行模型系數(shù)顯著性檢驗及方差分析，見表5和表6。

表5 真空冷凍干燥對戊糖片球菌存活率回歸模型的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance for regression equation of Pediococcus pentosaceus survival rate of vacuum freeze-drying

由表5方程回歸模型方差分析(ANOVA)可得，F(xiàn)=33.20 ＞ F0.01(9，4)=14.66，P ＜ 0.000 1，表明模型方程極顯著。失擬項p=3.42＞0.05，不顯著。模型的校正決定系數(shù)(Adj R2)為0.901 0，說明該模型能解釋90.1%響應(yīng)值的變化，該方程與實際擬合的較好，能有效反應(yīng)戊糖片球菌存活率與海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、脫脂乳之間的關(guān)系，因此所得的方程能預(yù)測響應(yīng)值隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

表6 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 6 Test of significance for regression coefficient of Pediococcus pentosaceus survival rate of vacuum freeze-drying

從表6的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，一次項中X1和X4(P＜0.01)的偏回歸系數(shù)極顯著，X2(P＞0.05)的偏回歸系數(shù)不顯著，X3(P＜0.05)的偏回歸系數(shù)顯著，說明海藻糖和脫脂乳對戊糖片球菌的存活率極顯著影響，蔗糖對戊糖片球菌的存活極顯著影響，谷氨酸鈉對存活率影響不顯著。交互項X1X4(P＜0.05)的交互作用對戊糖片球菌的存活率影響顯著，交互項 X1X2、X1X3、X2X3、X2X3、X2X4和 X3X4的 P值大于0.05，說明它們對存活率的影響不顯著，二次項的回歸系數(shù)均極顯著，對存活率影響極顯著。綜合上述分析得知，各因素對響應(yīng)值的影響程度為X1(海藻糖)＞X4(脫脂乳)＞X3(蔗糖)＞X2(谷氨酸鈉)。

2.4 保護劑對釀酒酵母菌存活率的響應(yīng)面分析

圖1～圖4為Design－Expert軟件對回歸方程構(gòu)建響應(yīng)面分析圖。圖1為固定蔗糖14%、脫脂乳12.5%情況下，不同含量的海藻糖和谷氨酸鈉對戊糖片球菌的影響，在海藻糖1%～1.4%，谷氨酸鈉4%～5.14%時，固定谷氨酸鈉，戊糖片球菌的存活率隨海藻糖的增加而增加。圖2為固定谷氨酸鈉5%和脫脂乳12.5%情況下，不同含量的海藻糖和蔗糖對戊糖片球菌的影響，在海藻糖含量1%～1.4%，蔗糖含量12%～14.24%的等高線可看出，固定海藻糖的用量，戊糖片球菌的存活率與蔗糖含量成正比。圖3和圖4分別是蔗糖、谷氨酸鈉和谷氨酸鈉、脫脂乳對戊糖片球菌的存活率的影響。

圖1 海藻糖、谷氨酸鈉及其相互作用對戊糖片球菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface plot and its contour plot showing the effects of trehalose，sodium glutamate and their mutual interactions on pediococcus pentosaceus survival rate

圖2 海藻糖、蔗糖及其相互作用對戊糖片球菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface plot and its contour plot showing the effects of trehalose，sucrose and their mutual interactions on Pediococcus pentosaceus survival rate

圖3 蔗糖、谷氨酸鈉及其相互作用對戊糖片球菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface plot and its contour plot showing the effects of sucrose，sodium glutamate and their mutual interactions on Pediococcus pentosaceus survival rate

圖4 谷氨酸鈉、脫脂乳及其相互作用對戊糖片球菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plot and its contour plot showing the effects of sodium glutamate，skim milk and their mutual interactions on Pediococcus pentosaceus survival rate

2.4 戊糖片球菌保護劑最佳配方的確定

在選取的各范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Design Expert軟件分析優(yōu)化得出，戊糖片球菌保護劑的最佳配方為海藻糖 1.38%，谷氨酸鈉 4.80%，蔗糖13.80%，脫脂乳13.50%。在此優(yōu)化條件下戊糖片球菌的存活率可達88.8%。為證實實驗結(jié)果，用實驗中得到的最佳配方重復(fù)實驗3次并取平均值，戊糖片球菌存活率可達88%，與預(yù)測值基本一致，說明該方程與實際情況擬合得較好，充分驗證了模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于戊糖片球菌保護劑成分的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

(1)VITEC－2 compact全自動微生物鑒定儀對煎餅發(fā)酵面糊中乳酸菌的鑒定結(jié)果為戊糖片球菌。

(2)通過單因素實驗，從葡萄糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂乳、乳糖和MnSO4等保護劑中，篩選效果較好的海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、脫脂乳4種保護劑應(yīng)用響應(yīng)面方法對復(fù)合保護劑進行優(yōu)化，確定保護劑的最佳配方為:海藻糖1.38%，谷氨酸鈉4.80%，蔗糖13.80%，脫脂乳13.50%，在此優(yōu)化條件下，戊糖片球菌的存活率可達88%。

［1］Schoug ?，Olsson J，Carlfors J，et al.Freeze－drying of Lactobacillus coryniformis Si3－effects of sucrose concentration，cell density，and freezing rate on cell survival and thermophysical properties［J］.Cryobiology，2006，53(1):119 －127.

［2］Ibanoglu S，Ainsworth P，Wilson G，et al.The effect of fermentation conditions on the nutrients and acceptability of tarhana［J］.Food Chemistry，1995，53(2):143 －147.

［3］Paludan－Müller C，Madsen M，Sophanodora P，et al.Fermentation and microflora of plaa－som，a Thai fermented fish product prepared with different salt concentrations［J］.International Journal of Food Microbiology，2002，73(1):61－70.

［4］Visessanguan W，Benjakul S，Smitinont T，et al.Changes in microbiological， biochemicaland physico－chemical properties of Nham inoculated with different inoculum levels of Lactobacillus curvatus［J］.LWT－Food Science and Technology，2006，39(7):814 －826.

［5］Gatlin L A，Nail S L.Freeze－drying:a practical overview［J］.Bioproc.－Techn，1994，18:317 －367.

［6］Jagannath A，Raju P S，Bawa A S.Comparative evaluation of bacterial cellulose nata as a cryoprotectant and carrier support during the freeze drying process of probiotic lactic acid bacteria［J］.LWT－Food Science and Technology，2010，43(8):1 197－1 203.

［7］Strasser S，Neureiter M，Geppl M，et al.Influence of lyophilization，fluidized bed drying，addition of protectants，and storage on the viability of lactic acid bacteria［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，107(1):167 －177.

［8］Schoug ?，Olsson J，Carlfors J，et al.Freeze－drying of Lactobacillus coryniformis Si3 －effects of sucrose concentration，cell density，and freezing rate on cell survival and thermophysical properties［J］.Cryobiology，2006，53(1):119 －127.

［9］Streeter J G.Effect of trehalose on survival of Bradyrhizobium japonicum during desiccation［J］.Journal of Applied Microbiology，2003，95(3):484 －491.

［10］曾小群，潘道東，包紅燕，等.干酪乳桿菌凍干保護劑研究［J］.中國食品學(xué)報，2013，13(1):44－50.

［11］YANG C，ZHU X，F(xiàn)AN D，et al.Optimizing the chemical compositions of protective agents for freeze－drying bifidobacterium longum BIOMA 5920［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2012，20(5):930－936.

［12］Aouadhi C，Simonin H，Prévost H，et al.Inactivation of Bacillus sporothermodurans LTIS27 spores by high hydrostatic pressure and moderate heat studied by response surface methodology［J］.LWT－Food Science and Technology，2012，50(2013):50 －56.

［13］高璃瓏，王允祥，江漢湖.超高壓殺菌條件的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37(10):1 544－1 549.

［14］吳華勇，黃贛輝，顧振宇，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化竹葉總黃酮的提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(11):196－200.

［15］曾慶梅，潘見，謝慧明，等.超高壓滅活枯草芽孢桿菌(AS 1.140)的參數(shù)優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2005，21(4):158－162.

［16］Crowe J H，Hoekstra F A，Crowe L M.Anhydrobiosis［J］.Annual Review of Physiology，1992，54(1):579－599.

［17］Jagannath A，Raju P S，Bawa A S.Comparative evaluation of bacterial cellulose as a cryoprotectant and carrier support during the freeze drying process of probiotic lactic acid bacteria［J］.LWT－Food Science and Technology，2010，43(8):1 197－1 203.

［18］PU Li－li，LIU Ning，ZHANG Ying－h(huán)ua ，et al.The research development of cryoprotector of lactic acid bacteria and its protective mechanism ［J］.Guangzhou Food Science and Technology，2005(1):147 －149.