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    乾州板鴨加工中肌肉蛋白質(zhì)及肌纖維的降解規(guī)律分析

    2014-12-16 08:04:44楊萬根謝瓊朱秋勁顧仁勇黃群余佶
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:板鴨風(fēng)干肌纖維

    楊萬根,謝瓊,朱秋勁,顧仁勇,黃群,余佶

    1(吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所,湖南吉首,416000)2(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽,550025)

    乾州板鴨是湘西吉首地區(qū)具有濃郁地方特色的傳統(tǒng)肉制品,制作的歷史可以追溯到清末時(shí)期。乾州板鴨以湘西麻鴨為原料,用肉桂、丁香、川椒、山奈、八角、白胡椒等上等香料制成的混合鹽香料進(jìn)行腌制。制作精良的乾州板鴨呈琵琶形,色澤金黃,油光發(fā)亮,肉質(zhì)細(xì)嫩,味香可口,風(fēng)味獨(dú)特。

    乾州板鴨要經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)20余天的腌制和15d風(fēng)干過程才能形成其獨(dú)特的風(fēng)味。在此過程中,由于內(nèi)源酶作用和微生物的作用,板鴨中會(huì)發(fā)生各種生化反應(yīng),其中包括蛋白質(zhì)的降解作用,形成氨基酸、肽類、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)[1]。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)南京板鴨研究較多[2-3],但由于2種板鴨的制作工藝不同,因此乾州板鴨的蛋白質(zhì)降解規(guī)律會(huì)與之存在差異。本研究以不同加工階段的乾州板鴨樣品為研究對(duì)象,通過SDS-PAGE電泳和掃描電鏡觀察蛋白質(zhì)的降解及肌肉纖維的變化情況。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    乾州板鴨,麻鴨,購(gòu)于乾州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),宰殺去毛,去除內(nèi)臟,洗凈,用香料腌制,出缸風(fēng)干;小分子標(biāo)準(zhǔn)樣品、牛血清蛋白、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、TEMED、β-巰基乙醇,Sigma 公司;SDS、NaH2PO4、Na2HPO4、KI、迭氮鈉、甘油、溴酚藍(lán)、甲醇、冰醋酸、Tris堿、過硫酸銨、HCl、甘氨酸、戊二醛、乙醇、CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、磺基水楊酸、KOH,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    EPS-300電泳儀、VE-180垂直電泳槽,上海天能科技有限公司;FD5-2.5冷凍干燥機(jī),Sim International Group;722可見分光光度計(jì)、JA2003電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;PHSJ-4A pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;FHS-2高速勻漿機(jī),金壇市億通電子有限公司;HH-S2恒溫水浴鍋,金壇市成輝儀器廠;TG165醫(yī)用離心機(jī),長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器,金壇市順華儀器有限公司;FESEM JEOL 6700F掃描電子顯微鏡(SEM),日本電子有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 全肌肉蛋白的提取

    采用Bechtel[4]的方法,將 4 g鴨胸肉剪碎,加入10 mL 提取液(2%SDS,10mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4,pH 7.0),然后勻漿 30 s,離心(1 500 × g,15 min),所得上清液即是全肌肉蛋白溶液。

    1.2.2 肌漿蛋白的提取

    采用 Bechtel[4]的方法,稱取 2 g 剪碎肉樣,加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸鹽緩沖液(PBS),使用高速分散器在6 000 r/min下勻漿3min,在離心力10 000×g及4℃下離心20 min,所得上清液即為肌漿蛋白。

    1.2.3 肌原纖維蛋白的提取

    采用Bechtel[4]的方法,上述離心沉淀重新懸浮于0.03 mol/L pH 6.5的PBS溶液中,在高速分散器中勻漿(6 000 r/min,4 min),然后離心(10 000 × g,4℃,20 min),去除上清液,重復(fù)以上操作3次,除去肌肉中的內(nèi)源蛋白酶,最終沉淀再次懸浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中,另加入KI和迭氮鈉使最終濃度分別為0.7 mol/L和0.02%,懸浮液在高速分散器中勻漿(7 000 r/min,3 min),然后離心(10 000×g,4℃,20 min),吸取上清即為肌原纖維蛋白。

    1.2.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

    用雙縮脲法[5]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白。

    1.2.5 SDS-PAGE 電泳方法

    采用Laemimli[6]不連續(xù)SDS-PAGE 電泳系統(tǒng),并參照汪家政等[7]和郭堯君[8]的方法。分離膠濃度為14%,濃縮膠濃度為4%。

    1.2.6 肌纖維的SEM測(cè)定

    將樣品細(xì)切成(0.3 ×1.0 ×1.0)cm 肉片,在2.5%戊二醛中于4℃下固定3 d,然后用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液逐級(jí)脫水(每級(jí)脫水30 min),再浸在乙酸異戊酯中置換30 min。完成置換的樣品凍干,粘臺(tái),噴金,SEM觀察、拍照。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 全肌肉蛋白的SDS-PAGE電泳

    全肌肉蛋白由10%的結(jié)締組織蛋白、30%的肌漿蛋白和60%的肌原纖維蛋白構(gòu)成。由圖1可知,在板鴨的加工過程中,第7天樣品的電泳圖與原料肉相似,說明全肌肉蛋白降解不明顯,但到了第14天,39 kDa條帶明顯消失,22 kDa條帶明顯變?nèi)酰f明全肌肉蛋白在此時(shí)有了明顯的降解。腌制第21天、風(fēng)干第7天和第14天產(chǎn)品與腌制第14天產(chǎn)品相比,蛋白質(zhì)條帶分布變化不大,但12 kDa處條帶隨加工時(shí)間延長(zhǎng)顏色變深,說明小分子質(zhì)量多肽增加。

    全肌肉蛋白發(fā)生降解,既可能是由內(nèi)源蛋白酶作用,也可能是因微生物生長(zhǎng)而分泌的外源蛋白酶作用。但從圖1看,39 kDa條帶和22 kDa條帶在4℃條件下腌制第14天時(shí)即有了較明顯的降解,因此微生物產(chǎn)生蛋白酶分解的可能性不大。因此推測(cè),在乾州板鴨加工中所發(fā)生的肌肉蛋白質(zhì)降解主要是內(nèi)源蛋白酶的作用。據(jù)報(bào)道,肌肉中起到降解蛋白質(zhì)作用的內(nèi)源蛋白酶主要是組織蛋白酶和鈣激活蛋白酶[9-10]。組織蛋白酶來源于肌細(xì)胞漿中的溶酶體,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近20種組織蛋白酶,其中的組織蛋白酶B、D、H和L在動(dòng)物屠宰后的肌肉蛋白質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[11]。鈣激活蛋白酶則在肉的成熟和嫩化作用中居于中心地位[12]。但研究發(fā)現(xiàn),鈣激活中性蛋白酶具有自溶作用,隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng),肉中鈣激活蛋白酶的活力逐漸下降,最后幾乎能完全失去活性[13]。Rosell等報(bào)道,火腿中鈣激活酶降解蛋白質(zhì)的作用僅發(fā)生在腌制的最初2周內(nèi)[14]。而組織蛋白酶在肉制品腌制過程中都有活性,例如在干腌火腿加工結(jié)束時(shí)仍保持約5%的活性[15]。因此,在腌制第21天前,由于組織蛋白酶和鈣激活蛋白酶的共同作用,蛋白質(zhì)較快的降解,但之后鈣激活蛋白酶活力減弱甚至消失,組織蛋白酶引起的蛋白質(zhì)組分變化較小,導(dǎo)致圖1中腌制第21天后的樣品之間蛋白質(zhì)組分分子量差異不大。

    圖1 板鴨加工過程中全肌肉蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of muscle protein during dry-salted duck processing

    2.2 肌漿蛋白的SDS-PAGE電泳

    圖2 板鴨加工過程中胸肉肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of breast sarcolasmic protein during dry-salted duck processing

    從圖2看出,在板鴨加工各階段中,原料樣的39 kDa處條帶在腌制第7天時(shí)已經(jīng)變?nèi)酰陔缰频?4天時(shí)消失,這與全肌肉蛋白前14 d變化規(guī)律一致,說明全肌肉蛋白39 kDa處的條帶變化是來源于肌漿蛋白的變化。15 kDa處條帶隨加工的進(jìn)程逐漸加深,到風(fēng)干第14天時(shí),形成了明顯的條帶,14 kDa處條帶也逐漸加深,說明板鴨在腌制過程中蛋白質(zhì)不斷發(fā)生降解,形成的多肽數(shù)量增多。

    2.3 肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳

    肌原纖維蛋白由肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白和肌球蛋白等組成,對(duì)肉制品的凝膠特性有重要影響[16]。

    圖3 板鴨加工過程中胸肉肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of breast myofibrilar protein during dry-salted duck processing

    如圖3所示,在板鴨的加工過程中,肌原蛋白的61 kDa條帶和43 kDa條帶在板鴨的加工過程中逐漸增強(qiáng),可能是加工過程中大分子條帶發(fā)生降解而成;而21 kDa條帶逐漸消失,則是這部分蛋白發(fā)生了水解。從腌制21天到風(fēng)干第14天,條帶變化不大,說明肌原纖維蛋白在這段時(shí)間內(nèi)降解不明顯。

    2.4 肌肉纖維的SEM結(jié)果

    乾州板鴨加工過程中肌肉纖維的變化如圖4所示。原料肉的肌纖維排列有規(guī)律、緊密,是完整的肌纖維,凍干后肌纖維間空隙很小。腌制14 d后,肌纖維的排列開始變得松散,凍干的樣品肌肉間空隙增大,但還呈較完整的肌纖維。風(fēng)干7 d后,完整的肌纖維開始斷裂成幾截。風(fēng)干14 d后,肌纖維斷裂的情況加劇,并且肌纖維的數(shù)量減少,空隙明顯增大。由SDS-PAGE分析結(jié)果可知,在腌制前14 d肌肉蛋白質(zhì)降解比較明顯,在腌制第21天至風(fēng)干第14天,雖然有一定的蛋白質(zhì)降解,但不明顯。因此可知,在腌制前14 d肌肉纖維內(nèi)部發(fā)生了蛋白質(zhì)的降解,但沒有顯現(xiàn)出來,在之后繼續(xù)的降解中,肌纖維結(jié)構(gòu)快速崩解。

    圖4 肉樣的電鏡掃描圖(a為放大100倍,b為放大200倍)Fig.4 Scanning electron micrograph of the meat

    3 結(jié)論

    細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解主要有四條途徑:溶酶體途徑,線粒體蛋白酶系統(tǒng)途徑,泛素-蛋白酶體途徑和胞液蛋白水解途徑[17]。動(dòng)物屠宰后,由于許多內(nèi)源酶如鈣激活酶、組織蛋白酶類的分解作用,肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解。在乾州板鴨的加工過程中,全肌肉蛋白、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在腌制的前14 d有明顯降解,而從腌制第21天到風(fēng)干第14天,肌肉蛋白降解不明顯。板鴨的肌肉纖維在經(jīng)過腌制和風(fēng)干后,從排列緊密變得松散,從完整的纖維斷裂成幾截,肌纖維的數(shù)量減少,肌纖維間的孔隙增大。

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