大果沙棘果渣黃酮體外抗氧化活性

摘要：采用超聲波法提取及大孔樹脂吸附法分離純化大果沙棘黃酮，以蕓香苷、兒茶素為對照，測定大果沙棘果渣黃酮對羥基自由基（·OH）、對超氧陰離子（ O-2· ）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力。結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標準對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強于粗提黃酮。

關(guān)鍵詞：大果沙棘；果渣；黃酮；抗氧化活性；純化

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0285-02

收稿日期：2013-12-27

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術(shù)與研究項目（編號：12521593） 。

作者簡介：焦巖（1981—），男，黑龍江肇東人，博士，講師，研究方向為植物活性物質(zhì)與功能食品。E-mail：jiaoyan_3000@126.com。沙棘（Hippophae rhamnoides L.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）酸刺屬植物，在俄羅斯、蒙古、中國等國分布較多[1-2]。沙棘含有豐富的黃酮類物質(zhì)，果實中黃酮含量為0.309%～0.945%。研究表明，沙棘果實中的黃酮類能增強人體的耐受性、減少毛細血管的滲透性，對血液中的膽固醇、甘油三酯有明顯的降低作用，對血垢、陳血細胞、血液中的垃圾有顯著的凈化作用[3-5]。目前，沙棘飲料加工過程中，常將沙棘果皮渣作為廢料丟棄，不僅造成環(huán)境污染，也是一種資源浪費。本研究分析大果沙棘果渣中的總黃酮含量及其抗氧化活性，旨在為大果沙棘的綜合加工利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

大果沙棘果渣由黑龍江省黑河市孫吳縣林業(yè)局提供。蕓香苷、兒茶素標準品、DPPH（1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl）、ABTS[2，2′-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt]購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鄰苯三酚等試劑均為國產(chǎn)分析純。756PC型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司），PHS-25型數(shù)顯pH計（上海精密科學儀器有限公司），ALC-110.4電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），XW-80A漩渦混合器（天津市歐諾儀器儀表有限公司），TDL-5型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2方法

1.2.1大果沙棘果渣總黃酮提取純化用超臨界CO2萃取設(shè)備將大果沙棘果渣脫脂。用75%乙醇作為溶劑，將脫脂后的大果沙棘果渣粉以10 mL ∶1 g液固比超聲波提取3次，將得到的黃酮液經(jīng)過離心、過濾、濃縮、除去乙醇等步驟，得到大果沙棘果渣黃酮溶液[6]。將黃酮溶液用X-5大孔樹脂層析柱進行純化，純化后真空凍干得到橙黃色固體粉末，采用 NaNO2-Al（NO3）3 比色法測定結(jié)果表明，分離前后大果沙棘果渣黃酮純度分別為11.9%、34.1%[7-8]。用甲醇溶解，配制成濃度分別為10～200 mg/L的黃酮溶液進行體外抗氧化試驗。

1.2.2大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用[9]在若干個10 mL比色管中依次加入10 mmoL/L水楊酸溶液0.5 mL，取0.5 mL不同濃度的純化前后的大果沙棘總黃酮溶液以及蕓香苷、兒茶素標準品溶液，加入0.5 mL 10 mmoL/L FeSO4 溶液、3.5 mL蒸餾水混合后加入5 mL 88 mmol/L H2O2溶液，啟動 Fenton反應(yīng)，混勻后于510 nm波長下測定吸光度D1。取0.5 mL蒸餾水代替10 mmoL/L FeSO4 溶液，510 nm波長下測定吸光度D2。取0.5 mL蒸餾水代替樣品溶液，510 nm波長下測定吸光度D3。羥自由基（·OH）清除率計算公式如下：

羥自由基清除率=[1-（D1-D2）/D3]×100%。

1.2.3對超氧陰離子（ O-2· ）的清除試驗[10]取pH值為 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，加入4.2 mL蒸餾水，混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 ℃下預(yù)熱的0.3 mL鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl配制），迅速搖勻后，于325 nm波長下每隔30 s測定1次吸光度，鄰苯三酚自氧化5 min后，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值ΔD0，用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為空白。在加入鄰苯三酚之前，加入不同體積的200 μg/mL純化前后的大果沙棘總黃酮溶液以及蕓香苷、兒茶素標準品溶液作為待測液，按照上述步驟測定每分鐘吸光度的增加值ΔD。 O-2· 清除率計算公式如下：

O-2· 清除率=（ΔD0-ΔD）/ΔD×100%。

1.2.4大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果[11]準確稱取20 mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容至250 mL，配制DPPH溶液。分別吸取10～100 mg/mL純化前后的大果沙棘總黃酮溶液以及蕓香苷、兒茶素標準品溶液 2.0 mL 置于具塞試管中（分2組），向其中一組加入DPPH溶液至2 mL，搖勻30 min后，用無水乙醇作參比在517 nm波長下測吸光度Di。測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度Dc。向另一組中加入無水乙醇至2 mL，混合后測其吸光度Dj。DPPH·自由基清除率K計算公式如下：

K=[1-（Di-Dj）/Dc]×100%。

1.2.5大果沙棘總黃酮清除ABTS+自由基的活力測定[12]將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光條件下靜置過夜，形成ABTS+自由基儲備液。該儲備液在室溫避光條件下穩(wěn)定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30 ℃、734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02。取100 μL不同濃度的大果沙棘黃酮及對照品溶液，加入2 mL ABTS+溶液，振蕩30 s，20 ℃下測定混合液在734 nm處6 min內(nèi)的吸光度變化。ABTS+自由基抑制率計算公式如下：endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0為未加樣品的ABTS+的吸光度；Dt表示樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；B表示空白樣品的吸光度；t=6 min。

2結(jié)果與分析

2.1大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除效果

由圖1可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，·OH清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后總黃酮對·OH的清除率分別為448%、54.9%，略低于兒茶素、蕓香苷標準品。對·OH的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.2大果沙棘總黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）的清除效果

由圖2可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為40～200 μg/mL時，對 O-2·清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為200 μg/mL時，純化前后黃酮對 O-2· 的清除率分別為539%、62.7%，低于兒茶素、蕓香苷標準品。對O-2·的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.3大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果

由圖3可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，對DPPH·自由基清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后黃酮對DPPH·自由基的清除率分別為49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘總黃酮對ABTS+自由基的清除效果

由圖4可知，當大果沙棘總黃酮濃度為20～40 μg/mL時，對ABTS+自由基清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮；但是當濃度大于60 μg/mL時，純化黃酮對ABTS+自由基的清除能力略大于蕓香苷，但始終小于兒茶素。

3結(jié)論

本研究探討了大果沙棘果渣總黃酮的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標準對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強于粗提黃酮，說明大果沙棘黃酮的純度及其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標準品對比也進一步證實了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

參考文獻：

[1]劉雪凌，權(quán)永榮，陳旭華. 沙棘產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（16）：8960-8961，8987.

[2]閆濤，羅麗梅，謝竹田，等. 沙棘的化學成分及生物功能的研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2010，31（1）：52-54.

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[4]Ercisli S，Orhan E，Ozdemir O，et al. The genotypic effects on the chemical composition and antioxidant activity of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries grown in Turkey[J]. Scientia Horticulturae，2007，115（1）：27-33.

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[7]杜瑞娟，張聰璐，梁寧，等. 大孔樹脂純化核桃楸皮總黃酮工藝[J].沈陽藥科大學學報，2013，30（4）：298-302.

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[10]趙丹丹，鄭鴻雁. 多年生藤本豆與大豆中黃酮類化合物體外抗氧化活性比較研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金東，湯昆. DPPH和ABTS法測定核桃仁的體外抗氧化活性[J].中成藥，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟慶煥，王化，王洪政，等. 牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.楊懷君，閻洪山，盧勇濤，等. 烏斯特智能在線檢測控制系統(tǒng)試驗分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：287-288.endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0為未加樣品的ABTS+的吸光度；Dt表示樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；B表示空白樣品的吸光度；t=6 min。

2結(jié)果與分析

2.1大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除效果

由圖1可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，·OH清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后總黃酮對·OH的清除率分別為448%、54.9%，略低于兒茶素、蕓香苷標準品。對·OH的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.2大果沙棘總黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）的清除效果

由圖2可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為40～200 μg/mL時，對 O-2·清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為200 μg/mL時，純化前后黃酮對 O-2· 的清除率分別為539%、62.7%，低于兒茶素、蕓香苷標準品。對O-2·的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.3大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果

由圖3可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，對DPPH·自由基清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后黃酮對DPPH·自由基的清除率分別為49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘總黃酮對ABTS+自由基的清除效果

由圖4可知，當大果沙棘總黃酮濃度為20～40 μg/mL時，對ABTS+自由基清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮；但是當濃度大于60 μg/mL時，純化黃酮對ABTS+自由基的清除能力略大于蕓香苷，但始終小于兒茶素。

3結(jié)論

本研究探討了大果沙棘果渣總黃酮的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標準對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強于粗提黃酮，說明大果沙棘黃酮的純度及其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標準品對比也進一步證實了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

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抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0為未加樣品的ABTS+的吸光度；Dt表示樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；B表示空白樣品的吸光度；t=6 min。

2結(jié)果與分析

2.1大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除效果

由圖1可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，·OH清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后總黃酮對·OH的清除率分別為448%、54.9%，略低于兒茶素、蕓香苷標準品。對·OH的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.2大果沙棘總黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）的清除效果

由圖2可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為40～200 μg/mL時，對 O-2·清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為200 μg/mL時，純化前后黃酮對 O-2· 的清除率分別為539%、62.7%，低于兒茶素、蕓香苷標準品。對O-2·的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.3大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果

由圖3可以看出，當大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，對DPPH·自由基清除率較高。當大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后黃酮對DPPH·自由基的清除率分別為49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘總黃酮對ABTS+自由基的清除效果

由圖4可知，當大果沙棘總黃酮濃度為20～40 μg/mL時，對ABTS+自由基清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮；但是當濃度大于60 μg/mL時，純化黃酮對ABTS+自由基的清除能力略大于蕓香苷，但始終小于兒茶素。

3結(jié)論

本研究探討了大果沙棘果渣總黃酮的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標準對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強于粗提黃酮，說明大果沙棘黃酮的純度及其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標準品對比也進一步證實了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

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