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    再力花葉斑病病原菌鑒定

    2014-11-15 14:25歐克芳李旭旭
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2014年9期
    關(guān)鍵詞:葉斑病

    歐克芳 李旭旭

    摘要:2008年以來,在武漢市再力花葉片上發(fā)現(xiàn)一種病害,該病發(fā)病初期為紅褐色針尖狀圓點,后擴展為圓形、橢圓形或不規(guī)則形,病斑中央灰白至灰褐色,斑緣紅褐色,外有黃色暈圈,病健交界明顯;發(fā)病后期病斑進一步擴展聯(lián)合成大病斑,發(fā)病嚴重的植株,多數(shù)葉片布滿病斑且干枯死亡,嚴重影響植株的光合作用和觀賞價值。從葉片上分離得到病菌,經(jīng)柯赫氏法則驗證,鑒定該病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate (Fr.) Keirssler]。該病菌為害再力花引起葉斑病在國內(nèi)尚屬首次報道。

    關(guān)鍵詞:再力花;葉斑??;病原鑒定;鏈格孢菌

    中圖分類號: S436.8+1文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2014)09-0113-02

    收稿日期:2013-11-20

    基金項目:湖北省武漢市建委項目(編號:武建2008-92);武漢市園林局項目(編號:武園2008-17)。

    作者簡介:歐克芳(1980—),女,湖北公安人,碩士,工程師,研究方向為濕地植物病蟲害。E-mail:oukefang@163.com。再力花(Thalia dealbata)別名水竹芋,為竹芋科再力花屬多年生宿根挺水草本,原產(chǎn)于美國南部和墨西哥[1]。再力花植株高大美觀,碩大的葉片翠綠可愛,花序高出葉面,亭亭玉立;花朵素雅別致,是一種觀賞價值極高的挺水花卉。再力花除有很高的觀賞價值外,還有較好的吸附重金屬、凈化水質(zhì)的作用[2-3],近年被新引入我國并被廣泛應用于濕地或公園水景,可配置香蒲、千屈菜、荷花等形成獨特的水體景觀,也可盆栽觀賞或種植于庭院水體景觀中。2008—2012年,在武漢市解放公園和月湖公園等再力花種植區(qū)進行調(diào)查時,發(fā)現(xiàn)再力花葉病斑發(fā)生普遍,嚴重影響其觀賞價值,目前,國內(nèi)尚未見再力花病害的研究報道。本研究對再力花葉病斑病原物進行分離、鑒定,以期明確病原菌,為該病害的防治提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1病原菌的分離與培養(yǎng)

    2012年4—11月,對武漢市解放公園、月湖公園、武漢植物園及武漢市園林科學研究所水生池種植區(qū)的再力花葉斑病發(fā)生和為害情況進行調(diào)查,并對田間病株出現(xiàn)的癥狀進行描述并拍照。采集典型病葉,用常規(guī)的組織分離法分離病葉:切取發(fā)病典型的再力花葉片病健交界處5 mm×5 mm的組織,先在70%乙醇中消毒5 s,再置于0.1% HgCl2中消毒1 min,無菌水漂洗3~4次,接種到PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖15 g、瓊脂15 g、水1 000 mL)中,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d,挑取組織塊周圍的菌落轉(zhuǎn)皿進行純化,獲得的純菌種保存于PDA斜面,置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2致病性測定

    將病原菌接種到PDA平板上活化,25 ℃條件下12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)10 d,用無菌水洗下分生孢子,配制成1×106個/mL的孢子懸浮液,選取健康再力花葉片,分別采用直接懸滴法和針刺懸滴法接種。接種前用無菌水將再力花表面蠟粉洗凈,葉片每側(cè)接種5~6個點,每個點接種約8 μL孢子懸浮液,以滴加8 μL無菌水的葉片為對照。每組接種30張葉片,重復3次,觀察發(fā)病情況。

    1.3病原菌形態(tài)觀察

    1.3.1病原菌菌落觀察活化病原菌,從菌落邊緣取直徑 5 mm 病原菌菌絲塊分別置于PDA培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基(馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂15 g、水1 000 mL)中,25 ℃培養(yǎng),觀察病原菌在2種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小、色素類型。

    1.3.2PCA培養(yǎng)基上病菌形態(tài)觀察將病菌接種到PCA培養(yǎng)基平板上,25 ℃條件下12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng) 5 d,在顯微鏡下觀察分生孢子梗與分生孢子形態(tài),并用目鏡測微尺測量分生孢子及分生孢子梗大小。

    1.3.3病原菌產(chǎn)孢表型觀察參照張?zhí)煊畹姆椒╗4],將病原菌接種到PCA平板上,25 ℃下12 h光照、黑暗交替培養(yǎng)1周后,從菌落邊緣切取小塊菌絲塊涂在孔心10 mm的滅菌濾紙上,然后將濾紙放在滅菌載玻片上,置無菌培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)5 d,取出載玻片,進行產(chǎn)孢表型觀察,并照相記錄。

    1.3.4自然寄主上病原菌形態(tài)觀察采集田間再力花病葉,用無菌水沖洗后保濕培養(yǎng)48 h,挑取典型病斑上的黑色霉層制作玻片,顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗特征,測量分生孢子及分生孢子梗大小。

    2結(jié)果與分析

    2.1葉斑病病害癥狀

    葉斑病主要危害再力花葉片,4月下旬開始發(fā)生,7—9月為發(fā)病盛期。發(fā)病初期為紅褐色針尖狀圓點,后擴展為圓形、橢圓形或不規(guī)則形,病斑中央灰白至灰褐色,斑緣紅褐色,外有黃色暈圈,病健交界明顯(圖1)。發(fā)病后期病斑進一步擴展聯(lián)合成大病斑,葉片上出現(xiàn)灰黑色霉狀物為病原菌子實體,葉正面多于葉背面。發(fā)病嚴重的植株,多數(shù)葉片布滿病斑且干枯死亡,嚴重影響植株的光合作用和觀賞價值。

    2.2病原菌致病性測定

    用真菌孢子懸浮液接種刺傷的再力花葉片,7 d后開始出現(xiàn)紅褐色針尖狀圓點,后病斑逐漸擴大;接種無傷的葉片

    10 d后開始出現(xiàn)感病癥狀;患病葉片表現(xiàn)出的癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似;對照未發(fā)病。從接種后發(fā)病的葉片組織再次分離到該致病菌,這說明該致病菌為葉斑病的病原菌。

    2.3病原菌的形態(tài)特征

    在PDA培養(yǎng)基上,該病原菌菌絲初期為白色,3 d后菌落灰白色,邊緣白色,背面褐色,后逐漸轉(zhuǎn)為墨綠色至黑色,短絨狀,菌落近圓形,平展,周緣整齊(圖2);4 d 后菌落直徑為46~49 mm,5 d后菌落直徑達55~58 mm。在PCA培養(yǎng)基上,菌落黑褐色,邊緣灰色,背面褐色,菌落近圓形,絨狀,平展(圖3);4 d 后菌落直徑為42~44 mm,5 d后菌落直徑達49~52 mm。

    3結(jié)論與討論

    通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化,結(jié)合自然寄主和純培養(yǎng),對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態(tài)、產(chǎn)孢特征等進行觀察,確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate (Fr.) Keirssler]。

    當前,分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統(tǒng)學研究和分類鑒定,尤其是5.8 S rDNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間區(qū)ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態(tài)差異不明顯,親緣關(guān)系接近,很難通過ITS序列分析加以區(qū)分,因此,對于小孢子種的區(qū)分仍以形態(tài)學為主。

    自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢菌,兩者形態(tài)特征較為相似,這說明在PCA培養(yǎng)基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基和PCA上菌落直徑不同,菌絲在營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基上生長較快,在營養(yǎng)相對匱乏的PCA培養(yǎng)基上生長較慢。另外,鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種,也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一,能引起多種植物病害,導致再力花發(fā)生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律和防治方法等有待進一步研究。

    參考文獻:

    [1]田軍東,史團省,朱世新,等. 引種植物水竹芋捕蟲行為的初步觀察研究[J]. 世界科技研究與發(fā)展,2007,29(3):62-65,38.

    [2]陳永華,吳曉芙,蔣麗鵑,等. 處理生活污水濕地植物的篩選與凈化潛力評價[J]. 環(huán)境科學學報,2008,28(8):1549-1554.

    [3]王驥,張?zhí)m英,盧少勇,等. 再力花/菖蒲生物濕地床去除河水中氮磷的試驗[J]. 吉林大學學報:地球科學版,2012,42(S1):408-414.

    [4]張?zhí)煊? 中國真菌志:鏈格孢屬[M]. 北京:科學出版社,2003:19-36.

    [5]Brower A V Z,Desalle R,Vogler A. Gene trees,species trees,and systematics:a cladistic perspective[J]. Ann Rev Ecol Syst,1996,27:423-450.顧麗嬙 . 殼寡糖對番茄灰霉病菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(9):115-117.

    3結(jié)論與討論

    通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化,結(jié)合自然寄主和純培養(yǎng),對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態(tài)、產(chǎn)孢特征等進行觀察,確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate (Fr.) Keirssler]。

    當前,分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統(tǒng)學研究和分類鑒定,尤其是5.8 S rDNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間區(qū)ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態(tài)差異不明顯,親緣關(guān)系接近,很難通過ITS序列分析加以區(qū)分,因此,對于小孢子種的區(qū)分仍以形態(tài)學為主。

    自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢菌,兩者形態(tài)特征較為相似,這說明在PCA培養(yǎng)基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基和PCA上菌落直徑不同,菌絲在營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基上生長較快,在營養(yǎng)相對匱乏的PCA培養(yǎng)基上生長較慢。另外,鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種,也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一,能引起多種植物病害,導致再力花發(fā)生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律和防治方法等有待進一步研究。

    參考文獻:

    [1]田軍東,史團省,朱世新,等. 引種植物水竹芋捕蟲行為的初步觀察研究[J]. 世界科技研究與發(fā)展,2007,29(3):62-65,38.

    [2]陳永華,吳曉芙,蔣麗鵑,等. 處理生活污水濕地植物的篩選與凈化潛力評價[J]. 環(huán)境科學學報,2008,28(8):1549-1554.

    [3]王驥,張?zhí)m英,盧少勇,等. 再力花/菖蒲生物濕地床去除河水中氮磷的試驗[J]. 吉林大學學報:地球科學版,2012,42(S1):408-414.

    [4]張?zhí)煊? 中國真菌志:鏈格孢屬[M]. 北京:科學出版社,2003:19-36.

    [5]Brower A V Z,Desalle R,Vogler A. Gene trees,species trees,and systematics:a cladistic perspective[J]. Ann Rev Ecol Syst,1996,27:423-450.顧麗嬙 . 殼寡糖對番茄灰霉病菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(9):115-117.

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    當前,分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統(tǒng)學研究和分類鑒定,尤其是5.8 S rDNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間區(qū)ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態(tài)差異不明顯,親緣關(guān)系接近,很難通過ITS序列分析加以區(qū)分,因此,對于小孢子種的區(qū)分仍以形態(tài)學為主。

    自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢菌,兩者形態(tài)特征較為相似,這說明在PCA培養(yǎng)基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基和PCA上菌落直徑不同,菌絲在營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基上生長較快,在營養(yǎng)相對匱乏的PCA培養(yǎng)基上生長較慢。另外,鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種,也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一,能引起多種植物病害,導致再力花發(fā)生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律和防治方法等有待進一步研究。

    參考文獻:

    [1]田軍東,史團省,朱世新,等. 引種植物水竹芋捕蟲行為的初步觀察研究[J]. 世界科技研究與發(fā)展,2007,29(3):62-65,38.

    [2]陳永華,吳曉芙,蔣麗鵑,等. 處理生活污水濕地植物的篩選與凈化潛力評價[J]. 環(huán)境科學學報,2008,28(8):1549-1554.

    [3]王驥,張?zhí)m英,盧少勇,等. 再力花/菖蒲生物濕地床去除河水中氮磷的試驗[J]. 吉林大學學報:地球科學版,2012,42(S1):408-414.

    [4]張?zhí)煊? 中國真菌志:鏈格孢屬[M]. 北京:科學出版社,2003:19-36.

    [5]Brower A V Z,Desalle R,Vogler A. Gene trees,species trees,and systematics:a cladistic perspective[J]. Ann Rev Ecol Syst,1996,27:423-450.顧麗嬙 . 殼寡糖對番茄灰霉病菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(9):115-117.

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