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    豬流行性腹瀉病毒流行毒株COE基因的原核表達(dá)及免疫原性分析

    2014-11-15 00:45:07霍軍宋予震董青
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年9期
    關(guān)鍵詞:原核表達(dá)免疫原性

    霍軍++宋予震++董青

    摘要:應(yīng)用RT-PCR方法從PEDV流行毒株中擴(kuò)增COE基因,并將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a,構(gòu)建 pET-32a-COE 重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,該重組蛋白獲得了表達(dá),主要以包涵體形式存在,分子量約為35.5 ku;Western-blot分析結(jié)果顯示,所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV小鼠血清反應(yīng)。應(yīng)用純化的重組蛋白加入弗氏佐劑免疫6周齡BALB/C小鼠并采集血清,ELISA檢測抗體效價(jià)達(dá)1 ∶3 200以上,說明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

    關(guān)鍵詞:豬流行性腹瀉病毒;COE基因;原核表達(dá);免疫原性;診斷抗原;PED基因工程疫苗

    中圖分類號(hào): S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)09-0034-02

    收稿日期:2013-12-03

    基金項(xiàng)目:2013年度河南省科技計(jì)劃(編號(hào):132102110147)。

    作者簡介:霍軍(1962—),男,河南信陽人,副教授,研究方向?yàn)閯?dòng)物解剖生理。Tel:(0371)65765528;E-mail:huojun@tom.com。豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起,臨床上以豬的急性腸炎、嘔吐、腹瀉、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征[1]。由于PEDV感染所引起的疾病與豬傳染性胃腸炎在臨床上難以區(qū)分,因此,對(duì)于PED的鑒別診斷往往需要借助實(shí)驗(yàn)室手段。

    S蛋白是冠狀病毒囊膜上的糖蛋白,負(fù)責(zé)病毒的吸附、融合和侵入宿主細(xì)胞,也是誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)的免疫原性蛋白。目前研制的冠狀病毒基因工程疫苗所選取的抗原基因主要集中在S基因上[2-4]。Chang等報(bào)道,豬流行性腹瀉病毒S基因存在中和抗原表位(COE),Brl/87株的COE基因?yàn)镾基因序列的1 495~1 914 bp[5];而韓國PEDV株的COE基因?yàn)镾基因序列的1 504~1 923 bp[6]。本試驗(yàn)結(jié)合上述文獻(xiàn),成功擴(kuò)增了PEDV流行毒株CH/HNZZ/13株S基因的 1 474~1 950 bp 處(包括COE基因),將其連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá),進(jìn)而探討將原核表達(dá)的重組COE蛋白作為診斷抗原的可行性;并為PED基因工程疫苗的研制提供參考。

    1材料與方法

    1.1PEDV陽性樣本

    2013年采集于河南省鄭州郊區(qū)某豬場PEDV陽性糞便樣本,命名為CH/HNZZ/13株。

    1.2主要試劑

    rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑(Rnase Inhibitor)、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司;Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購自TIANGEN公司;TRIzon Regent、 Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

    1.3PCR引物的設(shè)計(jì)

    參考PEDV CV777株全基因序列(GenBank:AF 353511)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,上游引物為CGGATCCCTTCTGAGTCACGAACAG,加入酶切位點(diǎn)BamHⅠ;下游引物為CCTCGAGGGTACACACATCCAGAGTCAT,加入酶切位點(diǎn)XhoⅠ。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.4樣本處理及RNA的提取

    將糞便樣本用PBS(0.01 mol/L,pH值7.2)進(jìn)行10倍稀釋并研磨,8 000 r/min離心10 min取上清備用,參照說明書使用TRIzon Regent提取RNA。

    1.5反轉(zhuǎn)錄與PEDV S基因片段的擴(kuò)增

    20 μL反轉(zhuǎn)錄體系:RNA模板10 μL,5×buffer 4 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,下游引物1 μL(20 pmol/μL),RNase抑制劑(40 U/μL)0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200 U/μL)0.5 μL,補(bǔ)加滅菌雙蒸水至20 μL;反應(yīng)條件為:42 ℃ 1 h,95 ℃ 5 min。50 μL PCR擴(kuò)增體系:10×buffer 5 μL,MgCl2(25 mmol/μL)5 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)5 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5 μL,上、下游引物(20 pmol/μL)各1 μL,補(bǔ)加滅菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95 ℃ 5 min;然后94 ℃ 1 min,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后再72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,回收目的片段連接至pMD18-T載體,陽性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-COE。

    1.6pET-32a-COE重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

    使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)pET-32a空質(zhì)粒和pMD18-T-COE進(jìn)行雙酶切,回收目的片段,并使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定,陽性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-COE。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中,在菌液D600 nm值為0.6~0.8時(shí)加入終濃度為1 mmol/mL的IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside),37 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的菌液1 mL于10 000 r/min離心5 min收集沉淀,加入細(xì)菌裂解液將其混勻后使用超聲波破碎菌體,破碎完全后10 000 r/min離心5 min后,分別取上清和沉淀加入適量的2×SDS凝膠上樣緩沖液后沸水煮 5 min,然后再8 000 r/min離心5 min后取上清進(jìn)行SDS- PAGE電泳分析,檢測目的蛋白的表達(dá)形式。

    1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

    使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,與抗PEDV小鼠陽性血清反應(yīng),再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行作用,最后使用DAB進(jìn)行顯色觀察。

    1.8目的蛋白的動(dòng)物免疫試驗(yàn)及ELISA檢測

    取6周齡左右昆明鼠20只,分成2組,每組10只。試驗(yàn)組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑;2周后進(jìn)行二免,每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑;2周后三免,方法與二免相同。對(duì)照組在3次免疫時(shí)均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進(jìn)行ELISA檢測,使用的ELISA方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA。

    2結(jié)果與分析

    2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

    通過RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV COE基因,連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定,結(jié)果雙酶切鑒定時(shí)在5 900 bp和491 bp左右有2條帶,PCR鑒定時(shí)在491 bp有1條特異性條帶(圖1),表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

    對(duì)含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析,重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達(dá),其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 ku,與預(yù)測大小相符。使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶(圖2),說明回收純化效果較好;將重組蛋白進(jìn)行復(fù)性,然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量,蛋白濃度為0.21 mg/mL。

    2.3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

    以純化的重組蛋白為抗原,以抗PEDV小鼠陽性血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測,結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶,說明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性(圖2)。

    2.4重組蛋白的免疫原性分析

    采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA方法檢測重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測結(jié)果表明,在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠,在三免后2周試驗(yàn)組小鼠的血清中ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1 ∶3200,而對(duì)照組未檢測到PED抗體。

    3討論

    本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達(dá)的蛋白有一定缺點(diǎn),主要是對(duì)包涵體的處理要先變性溶解后再進(jìn)行復(fù)性,才能得到溶解的具有活性的蛋白,且復(fù)性后蛋白活性容易降低;但它也有很大的優(yōu)點(diǎn),能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用,而且有利于目的蛋白的富集和分離純化,適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達(dá)載體本身帶有His標(biāo)簽,可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行目的蛋白的純化,然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶,未見雜帶,說明對(duì)目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示,所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽性血清反應(yīng),表明所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性,可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測。另外,將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠,可誘使小鼠機(jī)體產(chǎn)生高水平的PED抗體,說明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

    目前,由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國仍然十分嚴(yán)重,因此,急需建立可靠的PEDV抗體檢測方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測。本試驗(yàn)表達(dá)的針對(duì)PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達(dá)量高、反應(yīng)原性好,為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外,由于所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性,也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Debouck P,Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus,CV 777[J]. Am J Vet Res,1980,41(2): 219-223.

    [2]Liu R Y,Wu L Z,Huang B J,et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res,2005,112(1/2):24-31.

    [3]韋顯凱,侯繼波,姜平. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(10):1128-1132.

    [4]董麗娜,高鳳山,許崇波,等. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(12):1743-1747.

    [5]Chang S H,Bae J L,Kang T J,et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells,2002,14(2): 295-299.

    [6]Kang T J,Seo J E,Kim D H,et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification,2005,41(2):378-383.

    王志強(qiáng),俞紅賢,荊海霞,等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(9):36-39.

    1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

    使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,與抗PEDV小鼠陽性血清反應(yīng),再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行作用,最后使用DAB進(jìn)行顯色觀察。

    1.8目的蛋白的動(dòng)物免疫試驗(yàn)及ELISA檢測

    取6周齡左右昆明鼠20只,分成2組,每組10只。試驗(yàn)組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑;2周后進(jìn)行二免,每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑;2周后三免,方法與二免相同。對(duì)照組在3次免疫時(shí)均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進(jìn)行ELISA檢測,使用的ELISA方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA。

    2結(jié)果與分析

    2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

    通過RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV COE基因,連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定,結(jié)果雙酶切鑒定時(shí)在5 900 bp和491 bp左右有2條帶,PCR鑒定時(shí)在491 bp有1條特異性條帶(圖1),表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

    對(duì)含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析,重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達(dá),其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 ku,與預(yù)測大小相符。使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶(圖2),說明回收純化效果較好;將重組蛋白進(jìn)行復(fù)性,然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量,蛋白濃度為0.21 mg/mL。

    2.3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

    以純化的重組蛋白為抗原,以抗PEDV小鼠陽性血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測,結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶,說明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性(圖2)。

    2.4重組蛋白的免疫原性分析

    采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA方法檢測重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測結(jié)果表明,在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠,在三免后2周試驗(yàn)組小鼠的血清中ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1 ∶3200,而對(duì)照組未檢測到PED抗體。

    3討論

    本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達(dá)的蛋白有一定缺點(diǎn),主要是對(duì)包涵體的處理要先變性溶解后再進(jìn)行復(fù)性,才能得到溶解的具有活性的蛋白,且復(fù)性后蛋白活性容易降低;但它也有很大的優(yōu)點(diǎn),能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用,而且有利于目的蛋白的富集和分離純化,適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達(dá)載體本身帶有His標(biāo)簽,可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行目的蛋白的純化,然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶,未見雜帶,說明對(duì)目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示,所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽性血清反應(yīng),表明所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性,可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測。另外,將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠,可誘使小鼠機(jī)體產(chǎn)生高水平的PED抗體,說明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

    目前,由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國仍然十分嚴(yán)重,因此,急需建立可靠的PEDV抗體檢測方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測。本試驗(yàn)表達(dá)的針對(duì)PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達(dá)量高、反應(yīng)原性好,為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外,由于所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性,也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Debouck P,Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus,CV 777[J]. Am J Vet Res,1980,41(2): 219-223.

    [2]Liu R Y,Wu L Z,Huang B J,et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res,2005,112(1/2):24-31.

    [3]韋顯凱,侯繼波,姜平. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(10):1128-1132.

    [4]董麗娜,高鳳山,許崇波,等. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(12):1743-1747.

    [5]Chang S H,Bae J L,Kang T J,et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells,2002,14(2): 295-299.

    [6]Kang T J,Seo J E,Kim D H,et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification,2005,41(2):378-383.

    王志強(qiáng),俞紅賢,荊海霞,等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(9):36-39.

    1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

    使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,與抗PEDV小鼠陽性血清反應(yīng),再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行作用,最后使用DAB進(jìn)行顯色觀察。

    1.8目的蛋白的動(dòng)物免疫試驗(yàn)及ELISA檢測

    取6周齡左右昆明鼠20只,分成2組,每組10只。試驗(yàn)組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑;2周后進(jìn)行二免,每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑;2周后三免,方法與二免相同。對(duì)照組在3次免疫時(shí)均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進(jìn)行ELISA檢測,使用的ELISA方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA。

    2結(jié)果與分析

    2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

    通過RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV COE基因,連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定,結(jié)果雙酶切鑒定時(shí)在5 900 bp和491 bp左右有2條帶,PCR鑒定時(shí)在491 bp有1條特異性條帶(圖1),表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

    對(duì)含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析,重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達(dá),其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 ku,與預(yù)測大小相符。使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白,SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶(圖2),說明回收純化效果較好;將重組蛋白進(jìn)行復(fù)性,然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量,蛋白濃度為0.21 mg/mL。

    2.3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

    以純化的重組蛋白為抗原,以抗PEDV小鼠陽性血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測,結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶,說明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性(圖2)。

    2.4重組蛋白的免疫原性分析

    采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA方法檢測重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測結(jié)果表明,在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠,在三免后2周試驗(yàn)組小鼠的血清中ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1 ∶3200,而對(duì)照組未檢測到PED抗體。

    3討論

    本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達(dá)的蛋白有一定缺點(diǎn),主要是對(duì)包涵體的處理要先變性溶解后再進(jìn)行復(fù)性,才能得到溶解的具有活性的蛋白,且復(fù)性后蛋白活性容易降低;但它也有很大的優(yōu)點(diǎn),能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用,而且有利于目的蛋白的富集和分離純化,適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達(dá)載體本身帶有His標(biāo)簽,可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行目的蛋白的純化,然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶,未見雜帶,說明對(duì)目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示,所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽性血清反應(yīng),表明所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性,可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測。另外,將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠,可誘使小鼠機(jī)體產(chǎn)生高水平的PED抗體,說明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

    目前,由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國仍然十分嚴(yán)重,因此,急需建立可靠的PEDV抗體檢測方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測。本試驗(yàn)表達(dá)的針對(duì)PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達(dá)量高、反應(yīng)原性好,為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外,由于所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性,也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

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