海南野生疣柄魔芋組培快繁技術(shù)

潘登浪 曾憲海 鄒積鑫 周立軍　王軍 吳志祥 李文 林位夫

摘 要 為開發(fā)利用海南本地魔芋種質(zhì)資源，以海南本地野生疣柄魔芋球莖頂芽為外植體，研究其組培快繁技術(shù)。結(jié)果表明：外植體消毒以在0.1% HgCl2溶液中浸泡20 min為宜；采用MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L培養(yǎng)基，較有利于從頂芽基部直接誘導(dǎo)出叢芽，且增殖系數(shù)較高，達(dá)4.37；而叢芽分切成單芽后，在MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L培養(yǎng)基上的生根率可達(dá)100%。

關(guān)鍵詞 海南 ；疣柄魔芋 ；組織培養(yǎng) ；耐蔭植物

分類號 Q949.717.2

魔芋為天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus Blume）總稱，為多年生宿根草本植物[1]。魔芋塊莖經(jīng)過加工，在食品、飼料、工業(yè)、醫(yī)藥保健方面有廣泛用途[2-6]，深受廣大人們的喜愛。中國魔芋有2 000多年的栽培歷史，而國外始于20世紀(jì)初。據(jù)目前數(shù)據(jù)分析，國內(nèi)魔芋產(chǎn)品市場有20億元，日本年銷售6 000億日元，韓國、臺灣、歐美魔芋產(chǎn)品市場有60億～80億美元[4，7]。魔芋通過無性繁殖進(jìn)行繁育，生產(chǎn)上一般采用小種芋或?qū)⒋髩K莖分切成小塊莖繁育種苗，用種量大、增殖系數(shù)低、周期長，并且在貯藏、播種中易感病腐爛，同時由于種芋為營養(yǎng)器官多年留種累積病原容易造成種質(zhì)退化，嚴(yán)重限制了生產(chǎn)的發(fā)展和新品種的推廣。利用組培快繁技術(shù)可較好地解決這些難題，前人在魔芋組培快繁技術(shù)研究方面已有不少的報道[8-15]，但具有良好藥用[16-17]、食用[18]、飼用價值[3]的疣柄魔芋的組培技術(shù)未見相關(guān)報道。海南本地野生疣柄魔芋種質(zhì)資源具有耐蔭、抗病、塊莖大（單個球莖可達(dá)9 kg）等特點(diǎn)。鑒于此，本研究采用海南本地野生疣柄魔芋的球莖頂芽為外植體，開展組培快繁研究，以期建立海南本地野生疣柄魔芋的組培快繁技術(shù)體系，為海南省魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來源于海南省島內(nèi)自然闊葉林下的野生疣柄魔芋，采用其塊莖頂芽作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 不同消毒時間對外植體的消毒效果

將新芽長1～2 cm的魔芋球莖清洗干凈，切取帶頂芽新生幼嫩組織，置于自來水下沖洗1 h，剝除外層老皮，再用清水沖洗1次后移植超凈工作臺上，按無菌操作規(guī)程對外植體進(jìn)行消毒處理：外植體先用75%酒精浸泡30 s，再將其在0.1% HgCl2溶液中分別浸泡10、15、20、30 min，探索不同消毒時間對海南野生魔芋外植體消毒的效果。外植體經(jīng)HgCl2浸泡后，用無菌水洗5次，再用無菌濾紙將外植體表面水分吸干，接種于A培養(yǎng)基上進(jìn)行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。每處理接種20瓶，每瓶接種1塊外植體，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后，觀察統(tǒng)計外植體的污染、死亡情況。

A培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP（聚乙烯吡咯烷酮）1 g/L，pH6；培養(yǎng)條件：接種后外植體放置在溫度（27±2）℃條件下暗培養(yǎng)10 d，再置于同等溫度條件下連續(xù)弱光（光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d）培養(yǎng)。

1.2.2 不同濃度的6-BA對叢芽的增殖效果

將經(jīng)0.1% HgCl2浸泡20 min滅菌和在A培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d獲得的無菌材料轉(zhuǎn)接到添加不同濃度6-BA的增殖培養(yǎng)基CK、B1、B2、B3，探索不同濃度的6-BA對魔芋叢芽增殖的影響。每處理接種10瓶，每瓶接種2個芽，重復(fù)3次。培養(yǎng)60 d后，觀察統(tǒng)計各處理對叢芽增殖的效果。

CK：MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7g/L，pH 6.0；B1：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0；B2：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0；B3： MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0。接種后培養(yǎng)條件：溫度為（27±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。相關(guān)計算公式如下：

污染率=污染外植體個數(shù)/接種外植體個數(shù)×100%

死亡率=死亡外植體個數(shù)/未污染外植體個數(shù)×100%

叢芽增殖系數(shù)=繼代培養(yǎng)后芽個數(shù)/原接種芽個數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體消毒效果的影響

海南野生疣柄魔芋球莖（圖1）頂芽新生組織在0.1% HgCl2溶液中浸泡10～30 min，其不同消毒時間對外植體消毒效果不同。由表1可知，隨著消毒時間的延長，污染率降低，但死亡率升高。消毒10、15 min時，無外植體死亡，但污染率很高，分別為81.65%和70%；消毒30 min時，污染率低，僅為15%，但死亡率高達(dá)68.35%；消毒20 min時，外植體污染率為33.35%，死亡率為5%。綜合考慮污染率和死亡率的情況，以海南野生疣柄魔芋球莖頂芽新生組織為外植體，較理想的外植體消毒時間為20 min。另外，外植體在30 d的初代培養(yǎng)中，各處理均未產(chǎn)生側(cè)芽或叢芽，部分頂芽有所萌長，僅芽鱗片開裂，未長出葉片（見圖2）；各處理未出現(xiàn)外植體褐化現(xiàn)象。

2.2 不同濃度的6-BA對叢芽增殖的影響

將經(jīng)0.1% HgCl2浸泡20 min滅菌和在A培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d獲得的無菌材料轉(zhuǎn)接到添加不同濃度6-BA的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d，其叢芽增殖效果在0、1 mg/L差異不顯著，3、5 mg/L與其他濃度間存在顯著差異（見表2和圖3），6-BA濃度為0～5 mg/L時，隨著濃度的增大，增殖倍數(shù)先增大，在6-BA濃度達(dá)到3 mg/L時，增殖倍數(shù)最大為4.37，之后增殖倍數(shù)開始降低。6-BA濃度為5 mg/L時，增殖倍數(shù)為2.6，并且外植體長出愈傷組織。研究結(jié)果表明，6-BA濃度對海南野生疣柄魔芋球莖頂芽直接誘導(dǎo)叢芽效果明顯，其較佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 6.0。

2.3 生根壯苗培養(yǎng)

將叢芽分切成單芽，接種于生根壯苗培養(yǎng)基（MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 6.0）中。培養(yǎng)條件：溫度為（27±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。生根壯苗培養(yǎng)20 d后，抽葉率和生根率均為100%（見圖4）。

2.4 煉苗移栽

將經(jīng)生根壯苗培養(yǎng)獲得的具根、莖、葉組培苗移到室溫、500 lx自然光下，打開組培瓶蓋鍛煉3 d，然后移出組培瓶，用清水洗去粘附于植株上的培養(yǎng)基，移栽于花盆（12 cm×15 cm）中，移栽介質(zhì)組分椰糠∶表土=2∶1。移栽0～15 d，用薄膜密閉保濕，控制濕度90%以上，光照強(qiáng)度小于5 000 lx，移栽7 d后，開始長出新根。移栽15 d后，可掀開保濕膜進(jìn)行常規(guī)管護(hù)。移栽30 d后，調(diào)查移栽成活情況，其成活率為96%（見圖5）。

3 討論與結(jié)論

海南野生疣柄魔芋球莖頂芽通常生長在高溫高濕環(huán)境的土壤中，器官組織帶菌較多，消毒難度大，消毒時間短達(dá)不到滅菌效果，消毒時間長對外植體傷害大，綜合考慮后，外植體較為理想的消毒方法為：先經(jīng)75%酒精浸泡30 s，再經(jīng)0.1% HgCl2溶液浸泡20 min，最后用無菌水洗5次。 在本試驗中，海南野生疣柄魔芋球莖頂芽外植體初代誘導(dǎo)中基本未發(fā)現(xiàn)褐化現(xiàn)象，不同于白魔、花魔芋、紅魔芋外植體較易褐化[12，14-15]，可能是因為培養(yǎng)基中加入了PVP（聚乙烯吡咯烷酮），或海南野生疣柄魔芋球莖頂芽外植體本身多酚氧化物含量較少等，有待進(jìn)一步研究。

植物激素對魔芋的生長發(fā)育起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素與生長素比值有利于促進(jìn)腋芽的分化與生長，比值過高或過低都不利于腋芽的分化和生長，本結(jié)果與胡悅等[9]對花魔芋的研究結(jié)果相一致。促進(jìn)海南野生疣柄魔芋腋芽產(chǎn)生的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L。

本實驗初步建立了包括外植體消毒及其初代誘導(dǎo)、叢芽增殖、生根誘導(dǎo)、馴化移栽的海南疣柄魔芋組培快繁技術(shù)體系，達(dá)到了魔芋種苗的規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)水平，對推動海南省魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 李 恒，龍春林. 中國磨芋屬的分類問題[J]. 云南植物研究，1998，20（2）：167-170.

[2] 周光戶. 魔芋及其用途[J]. 南方農(nóng)業(yè)，2010，4（1）：35-36.

[3] 張盛林，劉佩英，張興國，等. 中國魔芋資源和開發(fā)利用方案[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，21（3）：215-219.

[4] 孫巧麗. 魔芋保健食品的加工開發(fā)及市場前景[J]. 中小企業(yè)管理與科技（下旬刊），2011，4（8）：92-93.

[5] 劉桂敏. 魔芋的藥用價值[J]. 中草藥，2004，35（8）：135-136.

[6] 張甫生，龐 杰，李文東，等. 魔芋精粉的性質(zhì)及其在糧食與飼料上的應(yīng)用[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2003，26（1）：23-25.

[7] 劉佩瑛，張盛林. 中國的魔芋產(chǎn)業(yè)[J]. 山區(qū)開發(fā)，2002，14（12）：37-38.

[8] 劉貴周，謝慶華，趙慶云，等. 魔芋組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2003， 19（4）：101-102，125.

[9] 胡 悅，冉興宇，張興國，等. 魔芋組培快繁的影響因素[J]. 中國蔬菜，2012，32（8）：75-79.

[10] 孫繼華，楊 超，劉菊華，等. 魔芋高效再生體系的建立與優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2012，33（1）：84-88.

[11] 張盛林. 西盟魔芋東川魔芋組培成苗[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，12（4）：355.

[12] 謝慶華，吳毅歆，張勇飛，等. 白魔芋外植體組培分化條件的研究[J]. 云南師范大學(xué)學(xué)報，2001，21（3）：66-69.

[13] 羅遠(yuǎn)華，朱文麗，伍立鋒，等. 大頭芋的組織培養(yǎng)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26（2）：16-18.

[14] 郭政宏，樂超銀，王 健，等. 花魔芋組織培養(yǎng)的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（25）：11 867-11 868.

[15] 蔣曉云，陳燕萍，常梅仙，等. 紅魔芋塊莖組培培養(yǎng)基篩選試驗[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2012，41（6）：22-23.

[16] 吳征錳，周太炎，肖培根. 新華本草綱要（第三冊）[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990：538.

[17] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草（第二十二卷第八冊）[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982：485.

[18] 熊緒杰. 雞爪芋化學(xué)成分及其藥理活性研究[D]. 廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2004：12.