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    氯沙坦對(duì)百草枯急性染毒大鼠肺組織氧化損傷的影響

    2014-11-12 07:31:26孫應(yīng)彪劉志飛
    關(guān)鍵詞:氯沙坦染毒肺泡

    郭 芳,孫應(yīng)彪,李 盛,蘇 莉,劉志飛,趙 遲

    (1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,甘肅蘭州 730000;2.蘭州市疾病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730030)

    百草枯(paraquat,PQ)屬有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑,對(duì)人畜均有較強(qiáng)毒性,因缺乏特效解毒劑及有效降低毒物毒性的治療手段,PQ急性中毒是臨床常見(jiàn)除草劑急性中毒之一,病死率高達(dá)50% ~80%[1]。氧化應(yīng)激是目前公認(rèn)的 PQ中毒機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),NF-κB作為一個(gè)氧化應(yīng)激敏感型轉(zhuǎn)錄因子可被PQ中毒后產(chǎn)生的大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)激活,使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),活化后的NF-κB還可進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)和肺組織纖維化的發(fā)生[2]。

    腎素-血管緊張素(angiotensin,Ang)系統(tǒng)廣泛存在于腎、心、肺和肝等組織,能夠獨(dú)自合成AngⅡ,AngⅡ是機(jī)體組織纖維化調(diào)節(jié)器,能夠通過(guò)AngⅡ1型受體(AngⅡ type 1 receptor,AT1R)的激活誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞的擴(kuò)散和肺間質(zhì)膠原蛋白沉積[3-4]。在正常大鼠肺組織中,存在大量 AT1R[5],AngⅡ與AT1R結(jié)合可引起肺成纖維細(xì)胞的擴(kuò)散進(jìn)而引起肺部嚴(yán)重?fù)p傷和肺纖維化。氯沙坦作為AT1R拮抗劑,可保護(hù)由高氧引起的小鼠肺損傷并抑制肺部纖維化的發(fā)生[6]。本研究通過(guò)建立PQ急性肺損傷大鼠模型,觀察氯沙坦對(duì)PQ所致肺組織形態(tài)、氧化應(yīng)激和NF-κB基因表達(dá)水平異常變化的干預(yù)作用,為臨床PQ急性中毒治療提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選擇SPF級(jí)成年雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量180~220 g,甘肅省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào) SCXK[甘]2011-0001-0001011。

    1.2 試劑和儀器

    PQ,美國(guó)Sigma公司;氯沙坦鉀片,杭州默沙東制藥有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxide,LPO)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所;Trizol試劑,美國(guó)Life Technology公司;NF-κB和β肌動(dòng)蛋白引物(表1),上海捷瑞生物工程有限公司;逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒,大連寶生物工程有限公司。Eon全功能多波段酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司;722型分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;BX53光學(xué)顯微鏡,日本Olympus公司;SmartSpec Plus核酸蛋白測(cè)定儀和 CFX96 Real-Time System,美國(guó) Bio-Rad 公司;Microfuge22R型低溫離心機(jī),美國(guó)Beckman公司;TC-512型普通PCR儀,北京瑞爾欣德科技有限公司。

    Tab.1 Primer sequences and theoretical amplification lengths

    1.3 動(dòng)物分組和處理

    選擇32只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PQ染毒組以及氯沙坦干預(yù)7 d(PQ+氯沙坦7 d)和14 d(PQ+氯沙坦14 d)組。正常對(duì)照組大鼠每天ig給予生理鹽水10 mL·kg-1,連續(xù)15 d。PQ染毒組一次性 ig PQ 40 mg·kg-1染毒,此后每天等容積ig給予生理鹽水至第15天。氯沙坦干預(yù)7和14 d組于一次性ig給予PQ 40 mg·kg-1染毒后次日,根據(jù)臨床成人每天用藥等效劑量ig給予氯沙坦10 mg·kg-1,每天1次,連續(xù)7和14 d。

    1.4 肺組織病理變化觀察

    各組大鼠于給藥第16天采用頸椎脫位法處死,取右肺中葉用4%多聚甲醛固定,常規(guī)制備石蠟切片并行HE染色,觀察肺組織病理學(xué)改變,以確定急性肺損傷造模是否成功。光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理組織學(xué)變化。剩余肺組織用無(wú)菌生理鹽水漂洗后液氮中凍存,用于其他指標(biāo)檢測(cè)。

    1.5 肺組織勻漿中 T-SOD,CAT,LPO和 T-AOC水平測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取左側(cè)肺組織,按質(zhì)量(g):體積(mL)=1∶9的比例加入無(wú)菌生理鹽水,冰水浴勻漿,1000×g離心10 min,取上清液BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,并根據(jù)試劑盒操作步驟檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo),結(jié)果用單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中各指標(biāo)含量表示。

    1.6 大鼠肺組織NF-κB mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

    取液氮中保存的肺組織約100 mg加入1 mL Trizol于冰浴中勻漿并提取總RNA,用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度并確保其A260nm/A280nm在1.8~2.2之間。根據(jù) RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),選擇10 μL反應(yīng)體系,于 37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃5 min將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,-20℃保存。以cDNA為模板,用 NF-κB引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,內(nèi)參照為β肌動(dòng)蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程嚴(yán)格按照SYBR Premix Ex TapⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。所有樣品均采用相同的閾值得到Ct值并采用Pfaffl法[7]計(jì)算NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 氯沙坦干預(yù)后大鼠肺組織病理改變

    如圖1所示,正常對(duì)照組肺泡間隔及肺泡腔大小如常,肺泡間隔內(nèi)未見(jiàn)明顯膠原沉積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)小血管管壁如常(圖1A)。PQ染毒組肺泡間隔彌漫性顯著增寬,肺泡腔狹窄或閉合,肺泡間隔及肺間質(zhì)內(nèi)大量膠原沉積,成纖維細(xì)胞增生,部分區(qū)域可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)小血管壁增厚,管腔狹窄(圖1B)。氯沙坦7 d干預(yù)組肺損傷比PQ組減輕,肺間質(zhì)膠原沉積減少,但多數(shù)區(qū)域肺間質(zhì)內(nèi)仍有成纖維細(xì)胞增生,間質(zhì)小血管管壁仍增厚(圖1C)。氯沙坦14 d干預(yù)組肺組織多數(shù)區(qū)域接近正常,肺間質(zhì)膠原沉積進(jìn)一步減少,間質(zhì)小血管管壁輕微增厚(圖1D)。

    Fig.1 Effect of losartan on paraquat(PQ)induced histopathological changes of lung tissuein rats(HE ×200).The rats were ig given losartan 10 mg·kg -1for 7 and 14 d after being single ig given PQ 40 mg·kg -1.A:normal control group;B:PQ group;C - D:losartan intervention for 7 and 14 d groups,respectively.The arrows show lung interstitial capillary.

    Tab.2 Effect of losartan on oxidative stress change in lung tissues of rats induced by PQ

    2.2 氯沙坦干預(yù)后大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的變化

    由表2可見(jiàn),與正常對(duì)照組比較,PQ染毒后大鼠肺組織中T-SOD和CAT活性明顯降低,T-AOC明顯減弱,LPO 含量明顯升高(P <0.05,P <0.01)。與PQ染毒組比較,氯沙坦干預(yù)7 d大鼠肺組織中T-SOD和CAT活性明顯回升(P<0.05,P<0.01),T-AOC活性和LPO含量無(wú)明顯變化;氯沙坦干預(yù)14 d T-SOD和CAT活性及T-AOC均明顯升高,LPO 含量明顯降低(P <0.05,P <0.01),均恢復(fù)接近正常水平。提示氯沙坦對(duì)PQ急性染毒大鼠肺組織中 T-SOD,CAT,T-AOC 和 LPO 活性或含量的異常變化具有逆轉(zhuǎn)作用。

    2.3 氯沙坦干預(yù)后大鼠肺組織NF-κB mRNA表達(dá)水平的變化

    由圖2可見(jiàn),與正常對(duì)照組比較,PQ組大鼠肺組織中 NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與PQ染毒組比較,氯沙坦干預(yù)7和14 d大鼠肺組織中 NF-κB mRNA含量明顯下降(P<0.05),基本恢復(fù)接近正常水平。

    Fig.2 Effect of losartan on NF-κB mRNA expression induced by PQ in lung tissue of rats by real-time quantitative PCR.See Fig.1 for the rat treatment.The NK-κB mRNA expression was analyzed by Pfaffl method.±s,n=8.*P <0.05,compared with normal control group;#P <0.05,compared with PQ group.

    3 討論

    據(jù)報(bào)道,肺泡上皮細(xì)胞和氣管Clara細(xì)胞借助多胺攝取途徑將PQ轉(zhuǎn)運(yùn)入肺并產(chǎn)生大量ROS,導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),進(jìn)而引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),使細(xì)胞膜受體、膜蛋白酶和離子通道脂質(zhì)的微環(huán)境發(fā)生改變,引起肺組織氧化性損傷[8]。正常情況下機(jī)體內(nèi)存在著消除自由基的防御體系,其中SOD和CAT活性直接反映機(jī)體清除ROS的能力[9]。據(jù)報(bào)道,PQ進(jìn)入人體內(nèi)后經(jīng)由NADPH輔助的單電子還原為自由基,該自由基能與氧反應(yīng)形成超氧陰離子,后者能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的ROS如過(guò)氧化氫、羥自由基等,間接使體內(nèi)SOD活力降低,并誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的LPO,最終引起肺泡間質(zhì)不可逆的纖維化[10-11]。本研究結(jié)果表明,PQ染毒組肺組織中SOD和CAT活性明顯降低,T-AOC明顯減弱,而LPO含量明顯升高,提示PQ中毒早期氧化應(yīng)激損害占有重要地位。

    NF-κB屬于對(duì)氧化還原敏感的Rel蛋白家族。因此,ROS的釋放和氧化還原狀態(tài)的改變可直接激活 NF-κB[12]。被活化的 NF-κB 引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡,大量炎性因子的產(chǎn)生導(dǎo)致肺部炎癥的發(fā)生并最終引起肺纖維化[2]。本研究結(jié)果表明,PQ染毒后大鼠肺組織病理改變主要表現(xiàn)為肺泡間隔顯著增寬,肺泡腔狹窄或閉合,部分區(qū)域可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原蛋白沉積;同時(shí)肺組織NF-κB mRNA明顯上調(diào)。提示NF-κB參與了PQ急性肺損傷過(guò)程。

    氯沙坦是常見(jiàn)的AT1R拮抗劑,可選擇性地作用于AT1R,以阻斷內(nèi)源性和外源性的AngⅡ所產(chǎn)生的各種生理反應(yīng)。在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型中,氯沙坦干預(yù)可顯著抑制AT1R和NF-κB活性[13]。此外,氯沙坦可通過(guò)抗自由基和阻斷AngⅡ的促炎反應(yīng)治療平陽(yáng)霉素引起的大鼠肺損傷[14]。本研究結(jié)果表明,隨著氯沙坦干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),PQ染毒組大鼠肺組織中SOD和CAT活性及T-AOC明顯增強(qiáng),LPO含量明顯降低,NF-κB mRNA表達(dá)明顯降低。肺組織病理觀察結(jié)果表明,氯沙坦干預(yù)14 d肺組織大多數(shù)區(qū)域未見(jiàn)明顯病變,并接近于正常水平。

    綜上所述,氯沙坦通過(guò)增強(qiáng)肺組織的抗氧化能力和降低NF-κB mRNA表達(dá)而減輕PQ所致的急性肺損傷,為臨床綜合治療PQ急性中毒提供新的思路。

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