TMEM16A鈣激活氯離子通道在Fisher大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的表達(dá)及其電生理特性研究*

郝 峰， 白雪松， 鞠曉紅， 方 芳， 藏雨軒， 朱杭飛， 向國艷， 張雲(yún)喬， 袁忠?！?/p>

鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一類在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的離子通道蛋白，因其通過胞漿中游離鈣離子而激活，并跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)含量最豐富的陰離子氯離子而命名為鈣激活氯離子通道［1］。鈣激活氯離子通道廣泛地存在于各種興奮性和非興奮性細(xì)胞上，在多種生理功能中發(fā)揮重要作用:例如，分泌蛋白及鹽的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)、阻止卵母細(xì)胞多重受精、嗅覺的信號(hào)傳導(dǎo)、平滑肌收縮、神經(jīng)元興奮和心臟動(dòng)作電位的復(fù)極化等;同時(shí)鈣激活氯離子通道也在多種病理過程中扮演重要角色，是腹瀉、高血壓、囊性纖維化和某些特定腫瘤等疾病潛在的藥物靶點(diǎn)［1-3］。早在上世紀(jì)80年代，科學(xué)家就在非洲爪蟾卵母細(xì)胞上記錄到了經(jīng)典的鈣激活氯離子通道電流，證實(shí)了鈣激活氯離子通道的存在。新近研究證實(shí)跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)［4-6］。雖然目前人們對(duì)鈣激活氯離子通道已經(jīng)有了一定了解，但對(duì)于鈣激活氯離子通道確切的生理和病理意義的認(rèn)識(shí)還十分有限。為了深入研究鈣激活氯離子通道確切的生理功能及其在某些疾病病理過程中的作用，本研究根據(jù)確定的TMEM16A序列，構(gòu)建其真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染入適合高通量篩選的Fisher大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(Fischer rat thyroid follicular epithelial cells，F(xiàn)RT細(xì)胞)中，獲得穩(wěn)定表達(dá)TMEM16A的FRT細(xì)胞克隆，并觀察其在FRT細(xì)胞表達(dá)和研究其電生理特性。

材料和方法

1 細(xì)胞株和動(dòng)物

FRT細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)麻彤輝教授饋贈(zèng)，采用F-12基本培養(yǎng)基、10% 胎牛血清、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(Heraeus)培養(yǎng)。6月齡野生型C57BL/6J小鼠由大連醫(yī)科大學(xué)麻彤輝教授饋贈(zèng)。

2 主要試劑

F-12基本培養(yǎng)基、兔抗V5多克隆抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗兔 IgGⅡ抗、尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、HEPES、NMDG 和 CsCl購自 Sigma;胎牛血清購自 Gibco;TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000、Lipofectamine LTX、殺稻瘟菌素、鈣離子載體 ionomycin、SuperScriptⅢ試劑盒和真核表達(dá)載體pUB6/V5-His B購自Invitrogen;真核表達(dá)載體pcDNA3.1-YFPH148Q/I152L為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;Expand Long Template PCR System購自Roche;限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa;λHind III fragments、φX174 DNA 核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品和T4連接酶購自Promega;質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen;DNA凝膠回收試劑盒購自Qiagen;酵母提取物和蛋白胨購自O(shè)xford;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或購自上海生工;所用引物由上海生工合成。

3 主要方法

3.1 TMEM16A真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 取C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜 100 mg，液氮研磨后加入TRIzol溶液3 mL，按照試劑盒說明書提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA完整性，NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)提取核酸的濃度和純度。GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的小鼠 TMEM16A(NM_178642.4)序列編碼區(qū)全長2 871 bp，根據(jù)全長設(shè)計(jì)特異性引物序列，下游引物去除終止密碼子，以使其C末端的V5表達(dá)，并加入保護(hù)堿基和相應(yīng)的酶切位點(diǎn) BamH I和 Xba I，上游引物 5′-ctggatccatgagggtccccgagaagtac-3′，下 游 引 物 5′-gatctagactcagcgcgtccccatggtactc-3′。參照試劑盒說明以總 RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以此cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，BamH I和Xba I雙酶切pUB6/V5載體和回收的PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，回收產(chǎn)物在T4連接酶作用下于16℃連接反應(yīng)12 h制備克隆連接液，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以含有氨芐青霉素的LB選擇性固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日挑取陽性克隆至5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液，搖床(37℃、200 r/min)12 h后提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后進(jìn)一步測(cè)序鑒定，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 穩(wěn)定表達(dá)TMEM16A細(xì)胞株的建立 轉(zhuǎn)染前，將10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)板中長勢(shì)良好的FRT細(xì)胞接種到6孔板中，16 h后細(xì)胞匯合度達(dá) 90%。取TMEM16A 真核表達(dá)載體2、4、8 μg，分別與10 μL Lipofectamine 2000混合，并輕彈混勻，室溫下孵育15 min。將DNA與Lipofectamine 2000混合液加入?yún)R合度為90%的FRT細(xì)胞的6孔板中，混勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后棄含有DNA與Lipofectamine 2000的培養(yǎng)液體，每孔加入2 mL的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMEM16A的表達(dá)情況和轉(zhuǎn)染效率。以轉(zhuǎn)染效率高的DNA和Lipofectamine 2000比例將TMEM16A轉(zhuǎn)染至FRT細(xì)胞，48 h后消化細(xì)胞，以1∶5∶10的比例將細(xì)胞分別接種于3個(gè)10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)板中，并加入含10 mg/L殺稻瘟菌素的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)(前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)FRT細(xì)胞在含有10 mg/L殺稻瘟菌素的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后全部死亡)，3周后挑取適宜的FRT細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，免疫熒光和RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定克隆表達(dá)TMEM16A的情況，選取純度和表達(dá)量高的FRT細(xì)胞克隆進(jìn)行有限稀釋實(shí)驗(yàn)3次(即計(jì)數(shù)30個(gè)FRT細(xì)胞，加入10 mL完全培養(yǎng)液，混勻后，各取100 μL培養(yǎng)液入96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)匯合度達(dá)70%后擴(kuò)大培養(yǎng)，免疫熒光和RT-PCR實(shí)驗(yàn)鑒定克隆表達(dá)TMEM16A的情況)，獲取表達(dá)量和純度高的TMEM16A陽性FRT細(xì)胞克隆。

3.3 免疫熒光技術(shù)鑒定TMEM16A的表達(dá) 選取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的FRT細(xì)胞，用PBS溶液沖洗細(xì)胞3次后，用含4%多聚甲醛的PBS溶液室溫20 min后，用含0.1%Triton X-100的PBS處理10 min，加入含2%BSA的PBS封閉液室溫封閉1 h。然后加入兔抗V5多克隆抗體(1∶200)，4℃過夜。PBS溶液洗細(xì)胞4次，每次搖床5 min，以Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgGⅡ抗(1∶500)室溫孵育30 min。PBS溶液洗細(xì)胞4次，每次搖床5 min。倒置熒光顯微鏡下(Olympus BX60)觀察并拍照。

3.4 RT-PCR鑒定TMEM16A的表達(dá) 選取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入TRIzol(提取6孔板中2孔細(xì)胞加入1 mL TRIzol)，按照說明書提取總RNA，以總RNA為模板，Oligo(dT)為逆轉(zhuǎn)錄的引物，在SuperScriptTMⅢ 逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以TMEM16A編碼區(qū)特異性引物PCR擴(kuò)增目的片段。TMEM16A上游引物5′-ggacctgggctatgaggttcag-3′，下游引物 5′-cagcgcgtccccatggtactc-3′。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，β-actin為內(nèi)參照。β-actin上游引物 5′-catcctgcgtctggacctg-3′，下游引物 5′-atctccttctgcatcctgtc-3′。

3.5 全細(xì)胞(whole-cell)膜片鉗技術(shù) 將狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞接種到玻片(Fisher)上，第2天置于倒置熒光顯微鏡下，并用電極外液灌流，電極入水后電阻約為4～6 MΩ，給予負(fù)壓形成GΩ高阻抗封接后，快速給予負(fù)壓使電極尖端的細(xì)胞膜破裂，形成whole-cell記錄模式，也可形成insideout記錄模式。如為whole-cell記錄模式，初始鉗制電壓為0 mV，記錄10 ms后，給予階梯式電壓刺激，電壓從-80 mV到+80 mV，每次增加20 mV，各記錄800 ms，800 ms后電壓變?yōu)? mV，繼續(xù)記錄100 ms(HEKA EPC9)。電極外液(bath solution)為140 mmol/L NMDG-Cl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES。電極內(nèi)液(pipette solution):0.8 mL高濃度鈣溶液和0.2 mL零濃度鈣溶液混合得到600 nmol/L Ca2+溶液即為電極內(nèi)液。高濃度鈣溶液(mmol/L):146 CsCl，2 MgCl2，5 Ca-EGTA-NMDG，8 HEPES，pH 7.3(300 mOsm);零濃度鈣溶液(mmol/L):146 CsCl，2 MgCl2，5 EGTA-NMDG，8 HEPES，pH 7.3(300 mOsm)。用SF-77B快速溶液轉(zhuǎn)換設(shè)備(Warner Instruments)進(jìn)行所有的灌流實(shí)驗(yàn)，鈣激活氯離子通道抑制劑NFA(50 μmol/L)為對(duì)照。

3.6 鹵族元素敏感的YFP-H148Q/I152L熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞接種到黑壁透明底的96孔板中，16 h后按照試劑盒說明將Lipofectamine LTX和YFP-H148Q/I152L混合物滴加入含有FRT細(xì)胞的96孔板中。36 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察YFP表達(dá)情況。以含鈣鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞3次，最后1次留50 μL PBS，加入含2 μmol/L鈣離子載體ionomycin的高碘溶液，記錄相對(duì)熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化 (Fluostar多功能酶標(biāo)儀，BMG)。具體設(shè)置如下:激發(fā)光波長500 nm，發(fā)射光波長540 nm。以每秒5個(gè)點(diǎn)的速度動(dòng)態(tài)檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度，其中前2 s為基線，2 s后以170 μL/s的速度向目的孔中注入120 μL含有ionomycin和高濃度碘離子的PBS緩沖液。未加ionomycin和加鈣激活氯離子通道抑制劑NFA(200 μmol/L)為對(duì)照組。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

細(xì)胞膜上TMEM16A通道對(duì)碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)的活性用相對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)值與時(shí)間變化曲線反映，利用自定義的3次方程計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度變化的初始速度，再乘以熒光強(qiáng)度的變化與碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)速度的常數(shù)0.002，即為通道對(duì)碘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)速度［7］。以SPSS 15.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TMEM16A真核表達(dá)載體的構(gòu)建

pUB6/V5-TMEM16A真核表達(dá)載體經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示載體中位于BamH I和Xba I兩酶切位點(diǎn)間的原有片段被分離，載體被切割成線性，結(jié)果顯示在5 500 bp和2 900 bp處有清晰條帶，分別與載體 pUB6/V5和TMEM16A大小一致，見圖1A。挑選陽性克隆送測(cè)序，部分測(cè)序結(jié)果見圖1B，中間為TMEM16A基因C末端的Xba I酶切位點(diǎn)，其上游為去除終止密碼子的TMEM16A基因，下游為pUB6/V5載體序列，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的TMEM16A序列比對(duì)完全一致。上述結(jié)果表明成功構(gòu)建 pUB6/V5-TMEM16A真核表達(dá)載體。

Figure 1.The results of double digestion(A)and sequencing(B)of pUB6/V5-TMEM16A.1:the pUB6/V5-TMEM16A plasmid digested by BamH I and Xba I;2:DNA marker.圖1 TMEM16A真核表達(dá)載體雙酶切和測(cè)序結(jié)果

2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞膜上可見到明亮的鮮紅色熒光;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TMEM16A的部分FRT細(xì)胞膜可見到明亮的鮮紅色熒光，而未轉(zhuǎn)染或未表達(dá)的FRT細(xì)胞未見到明亮的鮮紅色熒光，見圖2。結(jié)果表明小鼠TMEM16A可在蛋白水平異源表達(dá)于FTR細(xì)胞，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得純度和表達(dá)量高的FRT細(xì)胞克隆。

Figure 2. The protein expression of TMEM16A in FRT cells(×200).A:FRT cells stably expressed TMEM16A;B:FRT cells trasiently expressed TMEM16A.圖2FRT細(xì)胞TMEM16A蛋白的表達(dá)

3R T-PCR結(jié)果

結(jié)果顯示，在400 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符，見圖3。這證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞在mRNA水平表達(dá)TMEM16A，獲得穩(wěn)定表達(dá)TMEM16A的FRT細(xì)胞株。

4 全細(xì)胞膜片鉗的記錄結(jié)果

Figure 3.The mRNA expression of TMEM16A in the FRT cells detected by RT-PCR.1:PCR product of TMEM16A;2:DNA marker;3:PCR product of β-actin.圖3TMEM16A的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在穩(wěn)定表達(dá)TMEM16A的FRT細(xì)胞上記錄其電流特性。結(jié)果顯示，初始電壓0 mV時(shí)和600 nmol/L游離鈣離子存在時(shí)，電流為0，但隨著電壓的增加電流逐漸增大，即電流與電壓和時(shí)間呈正相關(guān)，且電流隨著時(shí)間的增加逐漸增大，見圖4A。圖4B顯示加入鈣激活氯離子通道抑制劑NFA后電流大小與圖A相比顯著下降。對(duì)A和B進(jìn)行整理和分析得出I/V曲線圖(電流與電壓的關(guān)系圖)，曲線呈明顯的外向整流特性，見圖4C。沒有轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞未記錄到電流，證明未轉(zhuǎn)染TMEM16A的FRT細(xì)胞本身并不表達(dá)TMEM16A，見圖4D。上述結(jié)果表明TMEM16A離子通道具有時(shí)間、電壓和鈣離子的依賴性以及外向整流特性，且鈣激活氯離子通道抑制劑NFA可抑制TMEM16A離子通道，證實(shí)本研究記錄的TMEM16A電流屬于經(jīng)典的鈣激活氯離子電流，TMEM16A是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)。

5 熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加入高濃度碘離子和鈣離子載體ionomycin后，相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著下降，見圖5A;而僅加入高濃度的碘離子或提前加入200 μmol/L NFA的對(duì)照組相對(duì)熒光強(qiáng)度無明顯變化，見圖5B。Ionomycin可迅速升高胞漿中鈣離子濃度，鈣離子濃度的升高可引起TMEM16A開放，TMEM16A可具有轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子的特性，使細(xì)胞外高濃度的碘離子內(nèi)流，使其敏感的YFPH148Q/I152L迅速淬滅，導(dǎo)致相對(duì)熒光強(qiáng)度迅速下降。而應(yīng)用鈣激活氯離子通道抑制劑 NFA后，TMEM16A氯離子通道受到抑制，此時(shí)對(duì)碘離子通透也受到抑制，相對(duì)熒光強(qiáng)度無明顯變化。根據(jù)公式計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)速度為0.12±0.01 d［I］/dt mM/s，對(duì)照組0.01 ±0.001 d［I］/dt mM/s，實(shí)驗(yàn)組碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)速度顯著高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)。上述結(jié)果表明表達(dá)于 FRT細(xì)胞膜上的TMEM16A具有鈣激活和轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子的特性，且常用的鈣激活氯離子通道抑制劑NFA可抑制其開放。

Figure 4.Currents of TMEM16A recorded in FRT cells(n=3).A:TMEM16A currents recorded in the FRT cells stably expressing TMEM16A at a holding potential at 0 mV，and pulsing to voltages between+80 mV and-80 mV(in steps of 20 mV)by the technique of whole-cell patch clamp;B:whole-cell currents of TMEM16A recorded in the FRT cells expressing TMEM16A at a holding potential at 0 mV，and pulsing to voltages between+80 mV and-80 mV(in steps of 20 mV)in the presence of 50 μmol/L NFA;C:current-voltage relationships immediately after whole-cell access;D:whole-cell TMEM16A currents recorded in the FRT cells without TMEM16A expression.圖4 全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果

Figure 5.TMEM16A assay based on the halide-sensitive YFP-H148Q/I152L in the FRT cells.A:representative trace showed cell fluorescence quenching upon the addition of extracellular I-plus ionomycin in the FRT cells stably expressing TMEM16A，speed:0.12 ±0.01 d［I］/dt mM/s;B:representative trace of control group，speed:0.01 ±0.001 d［I］/dt mM/s.圖5 鹵族元素敏感的YFP-H148Q/I152L檢測(cè)TMEM16A功能

討 論

哺乳動(dòng)物的氯離子通道根據(jù)其門控機(jī)制分為5類:囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子;電壓門控的氯離子通道;配體門控的氯離子通道;體積調(diào)控的氯離子通道和鈣激活氯離子通道［8-10］。自從上世紀(jì)80年代于非洲爪蟾卵母細(xì)胞上首次記錄到經(jīng)典的鈣激活氯離子通道電流后，人們提出多個(gè)鈣激活氯離子通道的候選者，遺憾的是后續(xù)研究證實(shí)并非是真正的鈣激活氯離子通道。TMEM16A是新近發(fā)現(xiàn)的一種鈣激活氯離子通道，其家族共有10個(gè)成員，目前已知TMEM16A和TMEM16B為鈣激活氯離子通道，而TMEM16F為鈣激活陽離子通道。一般認(rèn)為上皮細(xì)胞表達(dá)的鈣激活氯離子通道為TMEM16A，其在跨上皮液體和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用;而神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)鈣激活氯離子通道為TMEM16B，在調(diào)節(jié)動(dòng)作電位產(chǎn)生、感覺傳導(dǎo)和嗅覺產(chǎn)生等生理活動(dòng)中扮演重要角色［11］。本研究于小鼠視網(wǎng)膜中分離提取TMEM16A，并成功構(gòu)建pUB6/V5-TMEM16A真核表達(dá)載體，并將其異源表達(dá)在FRT細(xì)胞上，倒置熒光顯微鏡可見其清晰表達(dá)于FRT細(xì)胞膜上，具有膜蛋白特性。本研究應(yīng)用檢測(cè)離子通道金標(biāo)準(zhǔn)的膜片鉗實(shí)驗(yàn)研究其電生理特性，結(jié)果表明記錄到的TMEM16A電流呈時(shí)間、電壓和鈣離子依賴的特性，并可被鈣激活氯離子通道抑制劑NFA抑制，具有經(jīng)典的鈣激活氯離子通道電流特性，證實(shí)TMEM16A是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)。

目前對(duì)TMEM16A鈣激活氯離子通道的特性已經(jīng)有了一定了解，但仍有很多亟待解決的問題［12］，例如TMEM16A離子通道參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的組成成分是什么?哪些氨基酸是TMEM16A離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵氨基酸?本研究構(gòu)建的TMEM16A真核表達(dá)載體是研究上述問題的關(guān)鍵工具，應(yīng)用TMEM16A的表達(dá)載體可定點(diǎn)突變TMEM16A基因，進(jìn)一步應(yīng)用膜片鉗和鹵族元素敏感的YFP蛋白等檢測(cè)TMEM16A的功能，可證實(shí)TMEM16A中參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵氨基酸。另外TMEM16A的某些生理功能和病理過程的作用仍未明了［13-16］，例如TMEM16A在血管收縮中是否扮演關(guān)鍵角色?TMEM16A與細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡和發(fā)育中的確切作用機(jī)制如何?過表達(dá)是研究目的基因作用機(jī)制的公認(rèn)方法，可將TMEM16A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞，通過比較過表達(dá)和正常表達(dá)TMEM16A的差異，來研究TMEM16A在細(xì)胞中的具體作用。此外經(jīng)過多次有限稀釋的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的量在理論上均勻一致，解決了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞因目的通道膜蛋白表達(dá)不一致造成的電流大小不同，而引起的結(jié)果分析的困難問題;本研究獲得的高表達(dá)TMEM16A的細(xì)胞株可作為研究TMEM16A在增殖、遷移和凋亡中作用的對(duì)照。此外本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的TMEM16A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型也是研究TMEM16A的必須工具，可應(yīng)用于下述關(guān)于TMEM16A的研究，例如除鈣離子外的其它二價(jià)陽離子對(duì)TMEM16A鈣激活氯離子通道的激活作用和親和力情況等相關(guān)研究。

膜片鉗是研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”［8］，本研究不僅應(yīng)用了全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來研究TMEM16A的電生理特性，還應(yīng)用鹵族元素敏感的熒光蛋白YFPH148Q/I152L檢測(cè)TMEM16A對(duì)碘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。YFP-H148Q/I152L為黃色熒光蛋白的雙突變體，具有對(duì)碘離子等鹵族元素敏感的特性，可與碘離子可逆性結(jié)合，引起碘離子速度淬滅的特點(diǎn)。鈣激活氯離子通道不僅可轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)含量最豐富的氯離子，也具有轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子等陰離子的特性，因細(xì)胞中碘離子含量甚微，可排除其它陰離子的影響。YFP-H148Q/I152L不僅可用于檢測(cè)氯離子通道的功能，還廣泛應(yīng)用于氯離子通道調(diào)節(jié)劑高通量篩選研究［8-9］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用YFP-H148Q/I152L檢測(cè)其TMEM16A轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子的功能，結(jié)果表明其可被升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的ionomycin激活，細(xì)胞外液高濃度的碘離子內(nèi)流后引起YFP-H148Q/I152L相對(duì)熒光強(qiáng)度迅速下降，證實(shí)其具有鈣激活氯離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)碘離子的特性。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可應(yīng)用該細(xì)胞模型進(jìn)行TMEM16A鈣激活氯離子通道調(diào)節(jié)劑的篩選，目前為止缺少特異性強(qiáng)、親和力高的鈣激活氯離子通道調(diào)節(jié)劑是研究鈣激活氯離子通道的重要阻礙，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為高親和力和強(qiáng)特異性的TMEM16A調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)提供了高效的細(xì)胞模型［8，16］。

總之，本研究獲得的TMEM16A蛋白展示了經(jīng)典的鈣激活氯離子通道特性。本研究構(gòu)建的TMEM16A真核表達(dá)載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型為后續(xù)深入研究鈣激活氯離子生理過程、病理過程中的作用以及鈣激活氯離子通道調(diào)節(jié)的發(fā)現(xiàn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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