西洋參莖葉總皂苷對(duì)缺血/再灌注大鼠心肌線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡的影響*

李 冬， 劉 蜜， 陶天琪， 宋丹丹， 劉秀華△， 史大卓

心肌細(xì)胞凋亡廣泛存在于包括缺血性心臟病在內(nèi)的多種心血管疾病中，對(duì)病情發(fā)展和預(yù)后起著重要作用［1-2］。在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷過程中，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等均會(huì)引起細(xì)胞損傷，加重細(xì)胞凋亡［3］。如何有效保護(hù)缺血心肌組織，減輕I/R損傷后的細(xì)胞凋亡，是目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要問題之一［4］。在心肌I/R損傷過程中，Ca2+超載和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產(chǎn)生會(huì)造成線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)不可逆開放，大量分子質(zhì)量小于1.5 kD的物質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜，使線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)迅速降低，導(dǎo)致離子平衡失調(diào)，線粒體腫脹。mPTP開放使細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)從線粒體釋放入胞漿，激活線粒體凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死，加重心肌損傷［5-6］。ΔΨm下降作為再灌注期mPTP開放后的特異性改變，能反映mPTP的開放程度，也是線粒體凋亡通路激活的早期變化之一［7］。

西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)是西洋參莖葉的主要活性成分。既往研究發(fā)現(xiàn)，PQS具有抗心肌缺血、減輕I/R損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡［8-10］和改善心肌梗死后心室重構(gòu)等作用［11］，其機(jī)制與抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)［12-14］、增強(qiáng)抗氧化酶活性、減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等有關(guān)［15］。PQS能否通過維持再灌注后心肌細(xì)胞ΔΨm的穩(wěn)定、抑制線粒體凋亡通路激活而發(fā)揮對(duì)I/R心肌的保護(hù)作用?目前尚無相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心肌I/R損傷模型，觀察PQS對(duì)心肌I/R損傷后ΔΨm及線粒體凋亡通路的影響，探討其保護(hù)I/R心肌和發(fā)揮抗凋亡作用的可能機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物、試劑及儀器

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(150±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)為 SCXK(京)2012-0001］;PQS粉(純度為99.0%)由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供;環(huán)孢霉素A(cyclosporin A，CsA)購自諾華公司;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記 (TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒購自Promega;線粒體提取試劑盒購自凱基公司;兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗體和兔抗人Cyt C、GAPDH單克隆抗體均購自Cell Signal;兔抗人caspase-3多克隆抗體購自Merck Millipore;發(fā)光液Luminol Reagent購自Santa Cruz;其余化學(xué)試劑均購自Sigma-Aldrich;全自動(dòng)生化分析儀(Cotas 8000，Roche);熒光酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo);激光共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus)。

2 I/R大鼠模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠90只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，自由飲水，按照文獻(xiàn)［16］報(bào)道的方法復(fù)制心肌I/R模型:以2%戊巴比妥鈉(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，使大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖。胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，于胸骨左緣3～4肋間開胸，打開心包膜，分離脂肪墊，于左心耳下緣1 mm處以7號(hào)針線在冠狀動(dòng)脈左前降支 (left anterior descending coronary，LAD)下方穿縫合線，將充水(0.5 mL)的球囊墊于血管與結(jié)扎線間，結(jié)扎造成心肌缺血。心電圖監(jiān)測(cè)顯示ST段抬高0.2 mV為造模成功，持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線，抽出球囊，關(guān)胸，再灌注120 min。

健康成年SD大鼠 (280～320 g)，隨機(jī)分為6組，每組15只。(1)假手術(shù) (sham)組:與藥物組等量純凈水灌胃，每天1次，連續(xù)6周;(2)模型(I/R)組:與Sham組灌胃方式相同，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注120 min;(3)PQS+I/R組:PQS水溶液 (200 mg·kg-1·d-1)灌胃，每天1次，連續(xù)6周后行I/R組操作;(4)CsA組:再灌注開始前10 minCsA(10 mg·kg-1)腹腔注射，開胸后穿線，不結(jié)扎LAD;(5)CsA+I/R組:CsA(10 mg·kg-1)腹腔注射，余操作同I/R組;(6)PQS+CsA+I/R組:再灌注開始前10 min，CsA(10 mg·kg-1)腹腔注射，余操作同PQS+I/R組。復(fù)灌120 min后，經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血用于血清LDH含量測(cè)定，每組隨機(jī)選5只大鼠取全心行心梗面積檢測(cè)，另10只分別沿心臟長(zhǎng)軸橫切心肌組織用甲醛固定制備組織切片，或取左室梗死危險(xiǎn)區(qū)(area at risk，AAR)心肌組織迅速液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存用于相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)，并按文獻(xiàn)［17］報(bào)道的方法提取線粒體用于ΔΨm的測(cè)定。

3 方法

3.1 血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量測(cè)定 經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血約10 mL，肝素抗凝，靜止15～20 min后3 000 r/min離心10 min，收集血清，Eppendorf管分裝，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。以全自動(dòng)生化分析儀(Roche)測(cè)定血清心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH含量。

3.2 心肌梗死面積測(cè)定 按文獻(xiàn)［18］報(bào)道的方法，從LAD結(jié)扎點(diǎn)結(jié)扎LAD，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注1%伊文思藍(lán)(Evans blue)2 mL，將非缺血區(qū)藍(lán)染，顯示出缺血區(qū)心肌組織，取出心臟，置于-20℃冰箱冷凍20 min，垂直心臟長(zhǎng)軸橫切成厚度均為2 mm左右的5片心臟切片，用絲線按順序?qū)⑵浯?，置?%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑 (2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)磷酸緩沖液中。37℃避光孵育30 min，置于10%甲醛溶液中過夜，封片。正常心肌組織呈藍(lán)色，缺血非梗死區(qū)為紅色，梗死區(qū) (infarct size，IS)為灰白色，AAR為紅色與灰白色區(qū)域之和。掃描儀掃描成像，以Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4.1)計(jì)算各部分面積。參考文獻(xiàn)［19］方法，缺血心肌面積用AAR面積與左心室 (left ventricle，LV)面積之比AAR/LV表示，梗死面積用IS/AAR表示。

3.3 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 于左心室結(jié)扎部位以下垂直于心臟長(zhǎng)軸橫切厚約1 cm的心肌組織，置于10% 甲醛溶液中固定1周，常規(guī)石蠟包埋，制備3 μm切片，采用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)［20］。激光共聚焦顯微鏡觀察，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的綠色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域隨機(jī)取5個(gè)高倍視野 (×60)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比 (%)，以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)表示。

3.4 線粒體提取 依照線粒體提取試劑盒要求進(jìn)行操作:取各組復(fù)灌120 min大鼠左室前壁AAR區(qū)心肌組織150 mg，用剪刀將其剪成2 mm×2 mm×2 mm大小碎塊放入冰水浴的玻璃勻漿器內(nèi)，加入1.5 mL lysis buffer，上下研磨，將充分磨碎的組織液4℃離心5 min(800×g)，取上清0.5 mL加入0.5 mL medium buffer，4 ℃離心10 min(15 000 ×g)，離心后的上清含胞漿成分，將其留取后存于-80℃冰箱，沉淀物即為線粒體。向線粒體沉淀中加入0.2 mL wash buffer，以吸管吹打成懸液，4℃離心10 min(15 000×g)，棄上清。向沉淀物中加入0.l mL store buffer，重懸后于 -80℃冰箱保存用于ΔΨm檢測(cè)。

3.5 ΔΨm測(cè)定 以陽離子熒光染色劑羰花青 (5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC-1)標(biāo)記線粒體，參照文獻(xiàn)［21］方法進(jìn)行檢測(cè)。將 -80℃保存的線粒體懸液取出，冰槽內(nèi)融化，用ΔΨm反應(yīng)緩沖液 (0.21 mol/L甘露醇，0.07 mol/L蔗糖，5 mmol/L HEPES，pH 7.4)懸浮線粒體懸液 (含線粒體蛋白50 μg)，緩沖體系為2 mL。加入1 μL解偶聯(lián)劑羰基氰化物間氯苯腙(carboxyl cyanidem chlorophenylhydrazone，CCCP)30℃ 10 min，隨后加入0.2 mmol/L JC-1染色液3 μL，室溫避光孵育10 min，進(jìn)行ΔΨm測(cè)定。取100 μL上述反應(yīng)液移至載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察(單濾波):激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)590 nm，可見亮紅色熒光，如熒光強(qiáng)度顯著減弱，表明ΔΨm受到破壞。另取100 μL加入96孔板各孔中，即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、散發(fā)波長(zhǎng)590 nm下的熒光強(qiáng)度，結(jié)果以相對(duì)熒光單位(relative fluorescence unit，RFU)表示。

3.6 Western blotting 取大鼠左室前壁心肌組織(AAR區(qū))40 mg，按文獻(xiàn)［22］報(bào)道方法提取總蛋白，與分離線粒體后留取的含胞漿成分的上清一起，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，-80℃冰箱保存。取上述蛋白提取液(含蛋白80 μg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，12%分離膠)。電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%BSA封閉1 h，分別加入Bcl-2、Bax、Cyt C 和 GAPDH 單克隆抗體 (1∶1 000)和caspase-3多克隆抗體 (1∶100)4℃ 過夜孵育，其中caspase-3抗體可同時(shí)識(shí)別caspase-3酶原 (procaspase-3，分子量為32 kD)和剪切后的 caspase-3(cleaved caspase-3，分子量為17 kD);用1×TBST洗膜后，相應(yīng)Ⅱ抗孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯示蛋白條帶，采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析蛋白條帶的吸光度［integrated absorbance，IA=平均吸光度(A)×面積］，以靶蛋白IA與GAPDH IA的比值反映靶蛋白水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較;用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)進(jìn)行率的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PQS對(duì)心肌I/R損傷的影響

1.1 血清LDH I/R組血清LDH含量顯著升高，為sham組的1.06倍(P＜0.05)，CsA組LDH含量與sham組比較無顯著差異(P＞0.05);與I/R組比較，PQS+I/R、CsA+I/R及 PQS+CsA+I/R組血清LDH含量分別降低38.2%、31.0%和39.3%(P＜0.05);CsA+I/R組、PQS+CsA+I/R組 LDH含量與PQS+I/R組比較無顯著差異 (P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Effect of PQS on serum activity of LDH after I/R.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.圖1 PQS對(duì)血清LDH含量的影響

1.2 心肌梗死面積 Sham組AAR/LV為(43.8±3.1)%，I/R組為(47.1±4.6)%，PQS+I/R組為(42.3±4.8)%，CsA組為(43.1±7.7)%，CsA+I/R組為(45.5±5.9)%，PQS+CsA+I/R組為(43.6±4.9)%，組間無顯著差異(P＞0.05);sham組和CsA組大鼠無心肌梗死，I/R組 IS/AAR為(42.4±3.0)%;與I/R組相比，PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組IS/AAR分別降低50.3%、38.7%和39.4%(P ＜0.05)，PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R組間IS/AAR無顯著差異(P＞0.05)，見圖 2。

Figure 2.The effect of PQS on myocardial infarct size in the rats with Evans blue and TTC staining.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs I/R.圖2 PQS對(duì)心肌梗死面積的影響

1.3 心肌細(xì)胞凋亡 與sham組比較，I/R組心肌細(xì)胞AI升高6.08倍 (P＜0.05)，CsA組AI無顯著差異 (P＞0.05);與I/R組比較，PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組心肌細(xì)胞AI分別降低40.7%、46.4%和39.1%(P ＜0.05)，PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R組間AI無顯著差異(P ＞0.05)，見圖3。

2 PQS對(duì)ΔΨm的影響

激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示，sham組線粒體紅色熒光強(qiáng)度較高，與sham組相比，I/R組熒光強(qiáng)度減弱，CsA組熒光強(qiáng)度無明顯變化;與I/R組相比，PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組線粒體紅色熒光均顯著增強(qiáng)。熒光酶標(biāo)儀結(jié)果顯示，sham組RFU值為23.2±4.0，I/R組 RFU值為8.9±2.2，和sham組相比降低61.3%(P＜0.05)，CsA組RFU值與sham組無顯著差異(P＞0.05);PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組 RFU值分別為14.7±3.3、16.9±0.9和16.1±3.7，較 I/R組升高64.2%、88.3%和79.4%(P＜0.05)，3組間RFU值無顯著差異 (P＞0.05)，見圖4。

3 PQS對(duì)凋亡因子Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of PQS on cardiomyocyte apoptotic index(TUNEL staining，×60，scale bar=20 μm).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.圖3 PQS對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

與sham組比較，I/R組 Bcl-2蛋白表達(dá)降低65.1%(P＜0.05)，Bax為 sham組的2.3倍 (P＜0.05);CsA組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)與Sham組比較均無顯著差異(P＞0.05);與I/R組相比，PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組Bcl-2表達(dá)量分別為I/R組的1.9、1.8和2.0倍(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)分別較 I/R組降低46.3%、44.6%和48.7%(P＜0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和 PQS+CsA+I/R組Bcl-2和 Bax蛋白表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05)，見圖5。

Figure 4.The effect of PQS on mitochondrial membrane potential(×600，scale bar=20 μm).A:sham group;B:I/R group;C:PQS+I/R group;D:CsA group;E:CsA+I/R group;F:PQS+CsA+I/R group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.圖4 PQS對(duì)大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 5.The effect of PQS on the expression of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.圖5 PQS對(duì)I/R心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

4 PQS對(duì)Cyt C蛋白表達(dá)的影響

與sham組相比，I/R組大鼠心肌組織胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)量升高1.77倍 (P＜0.05)，CsA組胞漿Cyt C蛋白表達(dá)無顯著差異 (P＞0.05);與I/R組比較，PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組胞漿Cyt C蛋白表達(dá)量分別降低29.7%、32.5%和28.9%(P＜0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和 PQS+CsA+I/R組間胞漿Cyt C蛋白表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05)，見圖6。

Figure 6.The effect of PQS on the expression of cytosolic Cyt C in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.圖6 PQS對(duì)I/R心肌組織胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)的影響

5 PQS對(duì)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，各組pro-caspase-3蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);與sham組比較，I/R組可明顯誘導(dǎo)大鼠心肌組織caspase-3蛋白剪切活化，其cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加，為sham組的2.6倍(P＜0.05)，CsA組較sham組無明顯變化 (P＞0.05);與I/R組相比，PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量分別降低53.3%、47.3%和45.1%(P＜0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R組間無顯著差異 (P＞0.05)，見圖7。

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I/R可造成大鼠心肌細(xì)胞損傷，使血清LDH水平上升，心梗面積增大，細(xì)胞凋亡增多，ΔΨm下降，線粒體凋亡通路激活;PQS具有抗心肌I/R損傷作用，表現(xiàn)為降低I/R大鼠血清LDH水平，縮小心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制再灌注期ΔΨm降低，升高Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)，減少Cyt C和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，提示PQS的I/R心肌保護(hù)作用與維持再灌注期ΔΨm穩(wěn)定、抑制mPTP開放并減少mPTP開放后線粒體凋亡通路的激活有關(guān)。

Figure 7.The effect of PQS on the expression of apoptotic effector enzyme caspase-3 in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.圖7 PQS對(duì)I/R心肌組織caspase-3活化的影響

心肌I/R損傷時(shí)細(xì)胞膜通透性增加，心肌酶漏出，LDH作為靈敏度較高的心肌酶之一，其含量變化能較準(zhǔn)確地反映心肌損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PQS能顯著降低I/R后血清LDH含量，表明PQS可減輕I/R心肌損傷。心梗面積是反映心肌損傷程度的金指標(biāo)［23］，與I/R組相比，PQS能明顯縮小大鼠心梗面積，說明PQS對(duì)I/R心肌具有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷的一個(gè)重要形式［24-25］。與缺血期相比，缺血后再灌注可加速細(xì)胞凋亡［26］，且凋亡細(xì)胞主要存在于梗死周邊的心肌組織中［27］。本研究選用大鼠心肌AAR區(qū)進(jìn)行TUNEL染色，顯示I/R能使凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加，PQS治療可明顯降低凋亡細(xì)胞數(shù)量，AI值較I/R組下降，說明PQS具有抗I/R心肌細(xì)胞凋亡作用，與以往報(bào)道一致［13］。

在I/R過程中，線粒體基質(zhì)內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生、Ca2+超載等均會(huì)造成線粒體腫脹，ΔΨm下降，mPTP開放［28-29］。mPTP開放又可進(jìn)一步降低 ΔΨm，造成線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)，mPTP不可逆開放［30］;ΔΨm是衡量線粒體功能和mPTP開放程度的重要指標(biāo)之一［31］。mPTP不可逆開放可使Cyt C從損傷的線粒體外膜向胞漿釋放，與凋亡蛋白酶活化因子1和caspase-9的蛋白前體形成凋亡小體，在dATP的輔助下激活caspase-9，使caspase-3活化，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)，加劇I/R后的心肌細(xì)胞損傷［32-34］。作為線粒體凋亡通路下游的關(guān)鍵分子，caspase-3活化后的剪切形式cleaved caspase-3可反映細(xì)胞凋亡水平［35］。另外，Bcl-2家族在線粒體凋亡通路的激活中也發(fā)揮關(guān)鍵作用［36］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中的重要成員，Bcl-2主要分布于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周膜，抑制細(xì)胞凋亡;Bax主要存在于胞質(zhì)中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax能與mPTP的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)成分結(jié)合，導(dǎo)致mPTP開放，而 Bcl-2能抑制Bax和ANT的結(jié)合作用，Bcl-2/Bax對(duì)mPTP的調(diào)控位于線粒體凋亡通路的上游，也對(duì)mPTP開放及繼后的凋亡激活起到重要作用［37］。本研究通過激光共聚焦顯微鏡及熒光酶標(biāo)儀對(duì)ΔΨm進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)I/R能使心肌ΔΨm顯著降低，PQS能明顯提高心肌I/R損傷后ΔΨm水平;Western blotting結(jié)果顯示，與I/R組相比，PQS能使心肌Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax、cleaved caspase-3和胞漿Cyt C蛋白表達(dá)下降。該結(jié)果提示，PQS能抑制再灌注期ΔΨm下降，并減少mPTP開放后線粒體凋亡通路的激活。

CsA是效果明確的mPTP特異性抑制劑，它可通過與mPTP上親環(huán)蛋白D(cyclophilin D，CyP-D)結(jié)合，抑制mPTP開放［38-40］。但作為具有免疫抑制作用的藥物，CsA也可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如高血壓、鉀潴留、高鉀血癥和肝、腎功能衰竭等，限制了其臨床應(yīng)用［41］。本研究結(jié)果顯示，CsA能降低I/R后血清LDH含量，減小心梗面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定ΔΨm水平，升高Bcl-2蛋白表達(dá)，降低 Bax、Cyt C和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，但與PQS組比較無顯著差異。此外，與PQS或CsA單獨(dú)使用比較，PQS與CsA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)以上各指標(biāo)的作用亦無顯著差異，說明PQS和CsA對(duì)I/R心肌的保護(hù)作用、抗凋亡作用與對(duì)再灌注期ΔΨm的調(diào)控效果類似。

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