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    西洋參莖葉總皂苷對(duì)缺血/再灌注大鼠心肌線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡的影響*

    2014-11-08 02:28:02陶天琪宋丹丹劉秀華史大卓
    中國病理生理雜志 2014年9期
    關(guān)鍵詞:西洋參心肌細(xì)胞線粒體

    李 冬, 劉 蜜, 陶天琪, 宋丹丹, 劉秀華△, 史大卓

    心肌細(xì)胞凋亡廣泛存在于包括缺血性心臟病在內(nèi)的多種心血管疾病中,對(duì)病情發(fā)展和預(yù)后起著重要作用[1-2]。在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷過程中,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等均會(huì)引起細(xì)胞損傷,加重細(xì)胞凋亡[3]。如何有效保護(hù)缺血心肌組織,減輕I/R損傷后的細(xì)胞凋亡,是目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要問題之一[4]。在心肌I/R損傷過程中,Ca2+超載和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量產(chǎn)生會(huì)造成線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)不可逆開放,大量分子質(zhì)量小于1.5 kD的物質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜,使線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)迅速降低,導(dǎo)致離子平衡失調(diào),線粒體腫脹。mPTP開放使細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt C)從線粒體釋放入胞漿,激活線粒體凋亡通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死,加重心肌損傷[5-6]。ΔΨm下降作為再灌注期mPTP開放后的特異性改變,能反映mPTP的開放程度,也是線粒體凋亡通路激活的早期變化之一[7]。

    西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin,PQS)是西洋參莖葉的主要活性成分。既往研究發(fā)現(xiàn),PQS具有抗心肌缺血、減輕I/R損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡[8-10]和改善心肌梗死后心室重構(gòu)等作用[11],其機(jī)制與抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[12-14]、增強(qiáng)抗氧化酶活性、減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等有關(guān)[15]。PQS能否通過維持再灌注后心肌細(xì)胞ΔΨm的穩(wěn)定、抑制線粒體凋亡通路激活而發(fā)揮對(duì)I/R心肌的保護(hù)作用?目前尚無相關(guān)研究。因此,本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心肌I/R損傷模型,觀察PQS對(duì)心肌I/R損傷后ΔΨm及線粒體凋亡通路的影響,探討其保護(hù)I/R心肌和發(fā)揮抗凋亡作用的可能機(jī)制。

    材料和方法

    1 動(dòng)物、試劑及儀器

    清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠,體質(zhì)量(150±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)為 SCXK(京)2012-0001];PQS粉(純度為99.0%)由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供;環(huán)孢霉素A(cyclosporin A,CsA)購自諾華公司;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記 (TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)試劑盒購自Promega;線粒體提取試劑盒購自凱基公司;兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗體和兔抗人Cyt C、GAPDH單克隆抗體均購自Cell Signal;兔抗人caspase-3多克隆抗體購自Merck Millipore;發(fā)光液Luminol Reagent購自Santa Cruz;其余化學(xué)試劑均購自Sigma-Aldrich;全自動(dòng)生化分析儀(Cotas 8000,Roche);熒光酶標(biāo)儀(Multiskan MK3,Thermo);激光共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus)。

    2 I/R大鼠模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組

    SD大鼠90只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,術(shù)前禁食12 h,自由飲水,按照文獻(xiàn)[16]報(bào)道的方法復(fù)制心肌I/R模型:以2%戊巴比妥鈉(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后,使大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái),氣管插管,呼吸機(jī)輔助呼吸,記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖。胸骨正中切口,鈍性分離皮下組織及肌肉,于胸骨左緣3~4肋間開胸,打開心包膜,分離脂肪墊,于左心耳下緣1 mm處以7號(hào)針線在冠狀動(dòng)脈左前降支 (left anterior descending coronary,LAD)下方穿縫合線,將充水(0.5 mL)的球囊墊于血管與結(jié)扎線間,結(jié)扎造成心肌缺血。心電圖監(jiān)測(cè)顯示ST段抬高0.2 mV為造模成功,持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線,抽出球囊,關(guān)胸,再灌注120 min。

    健康成年SD大鼠 (280~320 g),隨機(jī)分為6組,每組15只。(1)假手術(shù) (sham)組:與藥物組等量純凈水灌胃,每天1次,連續(xù)6周;(2)模型(I/R)組:與Sham組灌胃方式相同,結(jié)扎LAD 30 min,再灌注120 min;(3)PQS+I/R組:PQS水溶液 (200 mg·kg-1·d-1)灌胃,每天1次,連續(xù)6周后行I/R組操作;(4)CsA組:再灌注開始前10 minCsA(10 mg·kg-1)腹腔注射,開胸后穿線,不結(jié)扎LAD;(5)CsA+I/R組:CsA(10 mg·kg-1)腹腔注射,余操作同I/R組;(6)PQS+CsA+I/R組:再灌注開始前10 min,CsA(10 mg·kg-1)腹腔注射,余操作同PQS+I/R組。復(fù)灌120 min后,經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血用于血清LDH含量測(cè)定,每組隨機(jī)選5只大鼠取全心行心梗面積檢測(cè),另10只分別沿心臟長(zhǎng)軸橫切心肌組織用甲醛固定制備組織切片,或取左室梗死危險(xiǎn)區(qū)(area at risk,AAR)心肌組織迅速液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存用于相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè),并按文獻(xiàn)[17]報(bào)道的方法提取線粒體用于ΔΨm的測(cè)定。

    3 方法

    3.1 血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量測(cè)定 經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血約10 mL,肝素抗凝,靜止15~20 min后3 000 r/min離心10 min,收集血清,Eppendorf管分裝,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。以全自動(dòng)生化分析儀(Roche)測(cè)定血清心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH含量。

    3.2 心肌梗死面積測(cè)定 按文獻(xiàn)[18]報(bào)道的方法,從LAD結(jié)扎點(diǎn)結(jié)扎LAD,經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注1%伊文思藍(lán)(Evans blue)2 mL,將非缺血區(qū)藍(lán)染,顯示出缺血區(qū)心肌組織,取出心臟,置于-20℃冰箱冷凍20 min,垂直心臟長(zhǎng)軸橫切成厚度均為2 mm左右的5片心臟切片,用絲線按順序?qū)⑵浯?,置?%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)磷酸緩沖液中。37℃避光孵育30 min,置于10%甲醛溶液中過夜,封片。正常心肌組織呈藍(lán)色,缺血非梗死區(qū)為紅色,梗死區(qū) (infarct size,IS)為灰白色,AAR為紅色與灰白色區(qū)域之和。掃描儀掃描成像,以Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4.1)計(jì)算各部分面積。參考文獻(xiàn)[19]方法,缺血心肌面積用AAR面積與左心室 (left ventricle,LV)面積之比AAR/LV表示,梗死面積用IS/AAR表示。

    3.3 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 于左心室結(jié)扎部位以下垂直于心臟長(zhǎng)軸橫切厚約1 cm的心肌組織,置于10% 甲醛溶液中固定1周,常規(guī)石蠟包埋,制備3 μm切片,采用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)[20]。激光共聚焦顯微鏡觀察,正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色,凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的綠色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域隨機(jī)取5個(gè)高倍視野 (×60),計(jì)數(shù)每個(gè)視野中凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比 (%),以凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)表示。

    3.4 線粒體提取 依照線粒體提取試劑盒要求進(jìn)行操作:取各組復(fù)灌120 min大鼠左室前壁AAR區(qū)心肌組織150 mg,用剪刀將其剪成2 mm×2 mm×2 mm大小碎塊放入冰水浴的玻璃勻漿器內(nèi),加入1.5 mL lysis buffer,上下研磨,將充分磨碎的組織液4℃離心5 min(800×g),取上清0.5 mL加入0.5 mL medium buffer,4 ℃離心10 min(15 000 ×g),離心后的上清含胞漿成分,將其留取后存于-80℃冰箱,沉淀物即為線粒體。向線粒體沉淀中加入0.2 mL wash buffer,以吸管吹打成懸液,4℃離心10 min(15 000×g),棄上清。向沉淀物中加入0.l mL store buffer,重懸后于 -80℃冰箱保存用于ΔΨm檢測(cè)。

    3.5 ΔΨm測(cè)定 以陽離子熒光染色劑羰花青 (5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl benzimidalyl carbocyanine iodide,JC-1)標(biāo)記線粒體,參照文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行檢測(cè)。將 -80℃保存的線粒體懸液取出,冰槽內(nèi)融化,用ΔΨm反應(yīng)緩沖液 (0.21 mol/L甘露醇,0.07 mol/L蔗糖,5 mmol/L HEPES,pH 7.4)懸浮線粒體懸液 (含線粒體蛋白50 μg),緩沖體系為2 mL。加入1 μL解偶聯(lián)劑羰基氰化物間氯苯腙(carboxyl cyanidem chlorophenylhydrazone,CCCP)30℃ 10 min,隨后加入0.2 mmol/L JC-1染色液3 μL,室溫避光孵育10 min,進(jìn)行ΔΨm測(cè)定。取100 μL上述反應(yīng)液移至載玻片上,在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察(單濾波):激發(fā)波長(zhǎng)490 nm,散發(fā)波長(zhǎng)590 nm,可見亮紅色熒光,如熒光強(qiáng)度顯著減弱,表明ΔΨm受到破壞。另取100 μL加入96孔板各孔中,即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定,檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、散發(fā)波長(zhǎng)590 nm下的熒光強(qiáng)度,結(jié)果以相對(duì)熒光單位(relative fluorescence unit,RFU)表示。

    3.6 Western blotting 取大鼠左室前壁心肌組織(AAR區(qū))40 mg,按文獻(xiàn)[22]報(bào)道方法提取總蛋白,與分離線粒體后留取的含胞漿成分的上清一起,用BCA法進(jìn)行蛋白定量,-80℃冰箱保存。取上述蛋白提取液(含蛋白80 μg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,12%分離膠)。電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%BSA封閉1 h,分別加入Bcl-2、Bax、Cyt C 和 GAPDH 單克隆抗體 (1∶1 000)和caspase-3多克隆抗體 (1∶100)4℃ 過夜孵育,其中caspase-3抗體可同時(shí)識(shí)別caspase-3酶原 (procaspase-3,分子量為32 kD)和剪切后的 caspase-3(cleaved caspase-3,分子量為17 kD);用1×TBST洗膜后,相應(yīng)Ⅱ抗孵育1 h?;瘜W(xué)發(fā)光ECL顯示蛋白條帶,采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析蛋白條帶的吸光度[integrated absorbance,IA=平均吸光度(A)×面積],以靶蛋白IA與GAPDH IA的比值反映靶蛋白水平。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較,q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較;用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)進(jìn)行率的比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 PQS對(duì)心肌I/R損傷的影響

    1.1 血清LDH I/R組血清LDH含量顯著升高,為sham組的1.06倍(P<0.05),CsA組LDH含量與sham組比較無顯著差異(P>0.05);與I/R組比較,PQS+I/R、CsA+I/R及 PQS+CsA+I/R組血清LDH含量分別降低38.2%、31.0%和39.3%(P<0.05);CsA+I/R組、PQS+CsA+I/R組 LDH含量與PQS+I/R組比較無顯著差異 (P>0.05),見圖1。

    Figure 1.Effect of PQS on serum activity of LDH after I/R.Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R.圖1 PQS對(duì)血清LDH含量的影響

    1.2 心肌梗死面積 Sham組AAR/LV為(43.8±3.1)%,I/R組為(47.1±4.6)%,PQS+I/R組為(42.3±4.8)%,CsA組為(43.1±7.7)%,CsA+I/R組為(45.5±5.9)%,PQS+CsA+I/R組為(43.6±4.9)%,組間無顯著差異(P>0.05);sham組和CsA組大鼠無心肌梗死,I/R組 IS/AAR為(42.4±3.0)%;與I/R組相比,PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組IS/AAR分別降低50.3%、38.7%和39.4%(P <0.05),PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R組間IS/AAR無顯著差異(P>0.05),見圖 2。

    Figure 2.The effect of PQS on myocardial infarct size in the rats with Evans blue and TTC staining.Mean±SD.n=5.#P<0.05 vs I/R.圖2 PQS對(duì)心肌梗死面積的影響

    1.3 心肌細(xì)胞凋亡 與sham組比較,I/R組心肌細(xì)胞AI升高6.08倍 (P<0.05),CsA組AI無顯著差異 (P>0.05);與I/R組比較,PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組心肌細(xì)胞AI分別降低40.7%、46.4%和39.1%(P <0.05),PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R組間AI無顯著差異(P >0.05),見圖3。

    2 PQS對(duì)ΔΨm的影響

    激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示,sham組線粒體紅色熒光強(qiáng)度較高,與sham組相比,I/R組熒光強(qiáng)度減弱,CsA組熒光強(qiáng)度無明顯變化;與I/R組相比,PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組線粒體紅色熒光均顯著增強(qiáng)。熒光酶標(biāo)儀結(jié)果顯示,sham組RFU值為23.2±4.0,I/R組 RFU值為8.9±2.2,和sham組相比降低61.3%(P<0.05),CsA組RFU值與sham組無顯著差異(P>0.05);PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組 RFU值分別為14.7±3.3、16.9±0.9和16.1±3.7,較 I/R組升高64.2%、88.3%和79.4%(P<0.05),3組間RFU值無顯著差異 (P>0.05),見圖4。

    3 PQS對(duì)凋亡因子Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

    Figure 3.The effect of PQS on cardiomyocyte apoptotic index(TUNEL staining,×60,scale bar=20 μm).Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R.圖3 PQS對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

    與sham組比較,I/R組 Bcl-2蛋白表達(dá)降低65.1%(P<0.05),Bax為 sham組的2.3倍 (P<0.05);CsA組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)與Sham組比較均無顯著差異(P>0.05);與I/R組相比,PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組Bcl-2表達(dá)量分別為I/R組的1.9、1.8和2.0倍(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)分別較 I/R組降低46.3%、44.6%和48.7%(P<0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和 PQS+CsA+I/R組Bcl-2和 Bax蛋白表達(dá)無顯著差異(P >0.05),見圖5。

    Figure 4.The effect of PQS on mitochondrial membrane potential(×600,scale bar=20 μm).A:sham group;B:I/R group;C:PQS+I/R group;D:CsA group;E:CsA+I/R group;F:PQS+CsA+I/R group.Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R.圖4 PQS對(duì)大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

    Figure 5.The effect of PQS on the expression of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R.圖5 PQS對(duì)I/R心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

    4 PQS對(duì)Cyt C蛋白表達(dá)的影響

    與sham組相比,I/R組大鼠心肌組織胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)量升高1.77倍 (P<0.05),CsA組胞漿Cyt C蛋白表達(dá)無顯著差異 (P>0.05);與I/R組比較,PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組胞漿Cyt C蛋白表達(dá)量分別降低29.7%、32.5%和28.9%(P<0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和 PQS+CsA+I/R組間胞漿Cyt C蛋白表達(dá)無顯著差異(P >0.05),見圖6。

    Figure 6.The effect of PQS on the expression of cytosolic Cyt C in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R.圖6 PQS對(duì)I/R心肌組織胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)的影響

    5 PQS對(duì)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

    結(jié)果顯示,各組pro-caspase-3蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05);與sham組比較,I/R組可明顯誘導(dǎo)大鼠心肌組織caspase-3蛋白剪切活化,其cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加,為sham組的2.6倍(P<0.05),CsA組較sham組無明顯變化 (P>0.05);與I/R組相比,PQS+I/R組、CsA+I/R組和PQS+CsA+I/R組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量分別降低53.3%、47.3%和45.1%(P<0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R組間無顯著差異 (P>0.05),見圖7。

    討 論

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,I/R可造成大鼠心肌細(xì)胞損傷,使血清LDH水平上升,心梗面積增大,細(xì)胞凋亡增多,ΔΨm下降,線粒體凋亡通路激活;PQS具有抗心肌I/R損傷作用,表現(xiàn)為降低I/R大鼠血清LDH水平,縮小心肌梗死面積,減少心肌細(xì)胞凋亡,抑制再灌注期ΔΨm降低,升高Bcl-2/Bax蛋白表達(dá),減少Cyt C和cleaved caspase-3蛋白表達(dá),提示PQS的I/R心肌保護(hù)作用與維持再灌注期ΔΨm穩(wěn)定、抑制mPTP開放并減少mPTP開放后線粒體凋亡通路的激活有關(guān)。

    Figure 7.The effect of PQS on the expression of apoptotic effector enzyme caspase-3 in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs I/R.圖7 PQS對(duì)I/R心肌組織caspase-3活化的影響

    心肌I/R損傷時(shí)細(xì)胞膜通透性增加,心肌酶漏出,LDH作為靈敏度較高的心肌酶之一,其含量變化能較準(zhǔn)確地反映心肌損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PQS能顯著降低I/R后血清LDH含量,表明PQS可減輕I/R心肌損傷。心梗面積是反映心肌損傷程度的金指標(biāo)[23],與I/R組相比,PQS能明顯縮小大鼠心梗面積,說明PQS對(duì)I/R心肌具有保護(hù)作用。

    細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷的一個(gè)重要形式[24-25]。與缺血期相比,缺血后再灌注可加速細(xì)胞凋亡[26],且凋亡細(xì)胞主要存在于梗死周邊的心肌組織中[27]。本研究選用大鼠心肌AAR區(qū)進(jìn)行TUNEL染色,顯示I/R能使凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加,PQS治療可明顯降低凋亡細(xì)胞數(shù)量,AI值較I/R組下降,說明PQS具有抗I/R心肌細(xì)胞凋亡作用,與以往報(bào)道一致[13]。

    在I/R過程中,線粒體基質(zhì)內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生、Ca2+超載等均會(huì)造成線粒體腫脹,ΔΨm下降,mPTP開放[28-29]。mPTP開放又可進(jìn)一步降低 ΔΨm,造成線粒體呼吸鏈解偶聯(lián),mPTP不可逆開放[30];ΔΨm是衡量線粒體功能和mPTP開放程度的重要指標(biāo)之一[31]。mPTP不可逆開放可使Cyt C從損傷的線粒體外膜向胞漿釋放,與凋亡蛋白酶活化因子1和caspase-9的蛋白前體形成凋亡小體,在dATP的輔助下激活caspase-9,使caspase-3活化,啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng),加劇I/R后的心肌細(xì)胞損傷[32-34]。作為線粒體凋亡通路下游的關(guān)鍵分子,caspase-3活化后的剪切形式cleaved caspase-3可反映細(xì)胞凋亡水平[35]。另外,Bcl-2家族在線粒體凋亡通路的激活中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中的重要成員,Bcl-2主要分布于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周膜,抑制細(xì)胞凋亡;Bax主要存在于胞質(zhì)中,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax能與mPTP的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)成分結(jié)合,導(dǎo)致mPTP開放,而 Bcl-2能抑制Bax和ANT的結(jié)合作用,Bcl-2/Bax對(duì)mPTP的調(diào)控位于線粒體凋亡通路的上游,也對(duì)mPTP開放及繼后的凋亡激活起到重要作用[37]。本研究通過激光共聚焦顯微鏡及熒光酶標(biāo)儀對(duì)ΔΨm進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)I/R能使心肌ΔΨm顯著降低,PQS能明顯提高心肌I/R損傷后ΔΨm水平;Western blotting結(jié)果顯示,與I/R組相比,PQS能使心肌Bcl-2蛋白表達(dá)升高,Bax、cleaved caspase-3和胞漿Cyt C蛋白表達(dá)下降。該結(jié)果提示,PQS能抑制再灌注期ΔΨm下降,并減少mPTP開放后線粒體凋亡通路的激活。

    CsA是效果明確的mPTP特異性抑制劑,它可通過與mPTP上親環(huán)蛋白D(cyclophilin D,CyP-D)結(jié)合,抑制mPTP開放[38-40]。但作為具有免疫抑制作用的藥物,CsA也可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng),如高血壓、鉀潴留、高鉀血癥和肝、腎功能衰竭等,限制了其臨床應(yīng)用[41]。本研究結(jié)果顯示,CsA能降低I/R后血清LDH含量,減小心梗面積,減少心肌細(xì)胞凋亡,穩(wěn)定ΔΨm水平,升高Bcl-2蛋白表達(dá),降低 Bax、Cyt C和cleaved caspase-3蛋白表達(dá),但與PQS組比較無顯著差異。此外,與PQS或CsA單獨(dú)使用比較,PQS與CsA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)以上各指標(biāo)的作用亦無顯著差異,說明PQS和CsA對(duì)I/R心肌的保護(hù)作用、抗凋亡作用與對(duì)再灌注期ΔΨm的調(diào)控效果類似。

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