人參中殘留有機氯農藥在人工胃腸液中的生物有效性

顧 炎，薛 健，常 琪，劉慧靈，劉新民

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193)

中藥材中有機氯農藥殘留問題受到社會各界的普遍重視，而人參作為重要的中藥材，其有機氯農藥殘留更是備受關注。制定科學的農藥殘留限量標準，對控制人參質量十分必要。而生物有效性作為人類健康風險評價中的關鍵因子，其重要性不言而喻。

目前，國際上的胃腸模擬法有十多種，其中比較成熟的有生理原理提取法 (PBET)［1］、荷蘭公共衛(wèi)生與環(huán)境國家研究院法 (RIVM)［2］、德國標準研究院法 (DIN)［3］以及人體腸道微生物生態(tài)模擬系統(tǒng)法 (SHIME)［4］等等。本實驗采用《中國藥典》2010年版附錄［5］中的配方配制模擬人工胃腸液，對人參藥材中有機氯農藥在消化道中的生物有效性進行了初步的探究，旨在更好地評價人參中有機氯農藥殘留對人體的危害性，為其農殘標準的制定提供一些建議與參考。

1 儀器與試劑

Agilent(7890型)氣相色譜分析儀 (配備電子捕獲檢測器)、HP-5色譜柱 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)(美國 Agilent公司)、DB-1701(30 m ×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱 (美國Agilent公司)、PL203/01型電子天平 (瑞士梅特勒)、SK250HP型超聲波清洗器 (上海科導儀器有限公司)、LABOROTA4000/4型旋轉蒸發(fā)器 (德國海道夫)、Feb-80型離心沉淀器 (金壇市醫(yī)療儀器廠)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (上海島韓實業(yè)有限公司)、SGK-5LB型低噪音空氣泵 (北京東方精華苑科技有限公司)。

分析純丙酮、石油醚、濃硫酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水硫酸鈉 (北京化工廠);優(yōu)級純濃硫酸 (國藥集團化學試劑有限公司);1.2萬U/g胃蛋白酶、1.3萬U/g胰酶 (北京鴻潤寶順科技有限公司);100 mg/L的49種有機氯農藥對照品(農業(yè)部環(huán)保所)，配制成質量濃度為0.05 mg/L的標準溶液。

本實驗中所用的人參藥材是在眾多的測試樣品中選出的殘留農藥種類較多 (8種)、殘留量較高的樣品，粉碎過篩。

2 方法與結果

2.1 人參樣品中有機氯農藥本底值測定［6-7］

2.1.1 樣品制備 稱取人參樣品2.0 g于100 mL具塞三角瓶中。加入丙酮-石油醚 (1∶1，V/V)30 mL超聲提取15 min，靜置，過濾。再用丙酮-石油醚 (1∶1)20 mL提取兩次，合并濾液，40℃水浴旋蒸濃縮至近干。將濃縮后的殘渣轉移至5 mL具塞刻度試管中，用石油醚定容至3 mL，小心加入1 mL濃硫酸，渦旋，離心，取上清液，加入2 mL水洗滌，離心，除去水層，有機層加入少量無水硫酸鈉干燥，離心，取上層清液，待測。

2.1.2 儀器分析 實驗選用HP-5毛細管柱定量，DB-1701中等極性柱輔助定性。進樣口溫度250℃，不分流進樣。升溫程序:初始溫度120℃保持1 min，以8℃/min的速度升溫至150℃保持2 min，以4℃/min的速度升溫至205℃保持6 min，再以5℃/min的速度升溫至270℃，最后以1℃/min的速度升溫至280℃，保持5 min。ECD檢測器溫度:300℃。載氣體積流量1 mL/min。尾吹氣流60 mL/min。進樣量1 μL。外標法定量。

2.2 人工胃液環(huán)境中人參中有機氯農藥的生物有效性測定

2.2.1 配制人工胃液［5］取稀鹽酸3.3 mL，加水約160 mL與胃蛋白酶2 g，搖勻后超聲15 min使得所有固體粉末溶解，加水稀釋成200 mL，即得。

2.2.2 胃模擬反應 稱取2.0 g人參樣品于100 mL具塞錐形瓶中 (包錫紙避光)，加入50 mL人工胃液，蓋上瓶塞，在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)搖床中以60 r/min振搖3 h后取出，冷卻，過濾。

2.2.3 樣品處理 將“2.2.2”項中所得濾液依次用100 mL、50 mL石油醚各萃取一次。合并萃取液，40℃旋蒸至近干，將濃縮后的殘渣轉移至5 mL具塞刻度試管中，用石油醚定容至3 mL，小心加入1 mL濃硫酸，渦旋，離心，取上清液，加入2 mL水洗滌，離心，除去水層，有機層加入少量無水硫酸鈉干燥，離心，取上層清液，待測。

2.2.4 儀器分析 分析條件同“2.1.2”項。

2.3 人工腸液環(huán)境中人參中有機氯農藥的生物有效性測定

2.3.1 配制人工腸液 取1.36 g磷酸二氫鉀，加100 mL水溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.8;另取胰酶2 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋成200 mL，即得。

2.3.2 腸模擬反應 稱取2.0 g人參樣品于100 mL具塞錐形瓶中 (包錫紙避光)，加入50 mL人工腸液，蓋上瓶塞，在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)搖床以60 r/min振搖5 h后取出，冷卻，過濾。

2.3.3 樣品處理 處理方法同“2.2.3”項。

2.3.4 儀器分析 分析條件同“2.1.2”項。

2.4 測定結果

2.4.1 圖1為HP-5柱條件下的對照品與人參本底值圖譜。

2.4.2 人參樣品中有機氯農藥本底值及人工胃腸液中有機氯農藥溶出量檢測，每份樣品制備3個平行，測定結果見表1。

2.4.3 通過人工胃腸液中有機氯農藥溶出量與人參樣品總農殘量的比值求得生物有效性值。結果詳見表2。

3 討論

圖1 HP-5柱條件下的對照品 (A)與人參本底值 (B)圖譜Fig.1 GC(HP-5)of the OCPs in Ginseng

表1 各樣品中有機氯農藥測定結果 (n=3)Tab.1 Concentration of organochlorine pesticides in each sample(n=3)

表2 人參中的有機氯農藥在人工胃腸液中生物有效性Tab.2 Bioavailability of organochlorine pesticides in Ginseng using the simulator of gastrointestinal tract

近年來，體外模擬法由于具有條件可控，穩(wěn)定性好，易于操作，可用于測試大批量樣品，同時還能避免活體實驗所帶來的倫理問題等優(yōu)點，越來越多的被應用于生物有效性的測定，在土壤中鉛、砷、鎘等無機物離子的生物有效性評估方面應用廣泛且卓有成效［8］。但有機污染物的測定相對較少，尤其是食物基質中的相關研究更為少見。這是因為有機污染物在人體消化道中的轉化過程比較復雜，與有機質含有量豐富的食物一同作為樣品測定難度較大。此外，目前不少測定的數(shù)據都是添加回收的方法獲得的［9-10］，不能準確體現(xiàn)實際污染樣品生物有效性的情況。

本實驗選取普查過程中獲得的有機氯農藥殘留量較高的人參樣品，通過簡單的胃腸道消化條件模擬，測定了人參中殘留有機氯農藥對人體的生物有效性，初步得到以下結果。

首先，從表2中可以看出，對8種檢測到的有機氯農藥，在小腸環(huán)境中的生物有效性數(shù)值大多都高于胃環(huán)境。六氯苯和五氯硝基苯，在人工腸液中的生物有效性比在人工胃液中的大了接近一倍。個別農藥，如β-六六六在兩種環(huán)境中，有效性數(shù)值相差較小。

其次，同一環(huán)境中，不同有機氯農藥的生物有效性也存在著較大差異。在胃環(huán)境中，生物有效性值最大的是氟蟲脲 (19%)，生物有效性值最小的是β-六六六 (6.9%)，相差1倍多。而在腸環(huán)境中生物有效性最大的則是五氯苯 (25%)，β-六六六的生物有效性值最小 (6.1%)，兩者相差接近3倍。由于本實驗使用的是自然殘留的人參樣品，不同種類的農藥殘留相差較大，濃度差異是否對結果造成影響，還有待于進一步的研究。

最后，在本實驗中，無論是腸環(huán)境還是胃環(huán)境中，有機氯農藥對人體的生物有效性都小于30%，最小的只有不到10%，這意味著隨著人參進入人體的那部分農藥，實際上最終能進入循環(huán)系統(tǒng)的只占了總量的一部分。由此可以給相關標準的制定一些提示:生物有效性的數(shù)據，對制定科學的限量標準具有一定意義。

本實驗中所使用的胃腸模擬配方是最簡單的一種，僅考慮了模擬液的pH和酶兩個因素，沒有考慮胃腸液中的有機物、無機鹽以及微生物等因素所帶來的影響，今后還應當進一步模擬胃腸條件進行相關研究，并比較不同條件下得出的結果的差異性。另外，體外模擬的實驗，最終都需要活體實驗加以驗證才能確認其正確性，因此，進行活體實驗對結果進行確證也是以后需要著重考慮的方向。

［1］Ruby M V，Davis A，Link T E，et al.Development of an in vitro screening test to evaluate the in vivo bioaccessibility of ingested mine-waste lead［J］.Environ Sci Technol，1993，27(13):2870-2877.

［2］Oomen A G，Hack A，Minekus M，et al.Comparison of five in vitro digestion models to study the bioaccessibility of soil contaminants［J］. EnvironSciTechnol， 2002，36(15):3326-3334.

［3］DIN19738-2004，Soil quality-Absorption availability of organic and inorganic pollutants from contaminated soil material［S］.

［4］Laird B D，Van de Wiele T R，Corriveau M C，et al.Gastrointestinal microbes increase arsenic bioaccessibility of ingested mine tailings using the simulator of the human intestinal microbial ecosystem［J］.Environ Sci Technol，2007，41(15):5542-5547.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版二部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅩA.

［6］Hao L，Xue J.Multiresidue analysis of 18 organochlorine pesticides in traditional Chinese medicine［J］.J Chromatogr Sci，2006，44(8):518-522.

［7］薛 健，郝麗麗，田金改，等.黨參中29種有機氯農藥的多殘留分析［J］.藥物分析雜志，2008，28(11):1861-1864.

［8］Wragg J，Cave M R.In-vitro methods for the measurement of the oral bioaccessibility of selected metals and metalloids in soils:a critical review［M］.British Geological Survey R＆D Technical Report P5-062/TR/01，Environmental Agency，Bristol，UK，2002:9－10.

［9］陸 敏，余應新，張東平，等.胡蘿卜中滴滴涕對人體生物有效性影響因素的體外研究［J］.環(huán)境化學，2009，28(2):220-224.

［10］陸 敏，韓姝媛，余應新，等.蔬菜中多溴聯(lián)苯醚的定量測定及其對人體的生物有效性［J］.分析測試學報，2009，28(1):1-6.