HPLC-ELSD法測(cè)定金線蓮提取物中金線蓮苷

萬 婷，熊富良

(武漢理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢 430070)

金線蓮Anoectochilus roxburghi，即花葉開唇蘭，又名金蠶、金線蘭等，是蘭科開唇蘭屬的一種多年生的草本植物［1］。它主要分布于亞洲的日本、中國、印度和尼泊爾等國，我國的福建、貴州、臺(tái)灣等省也都有比較豐富的金線蓮資源［2］。金線蓮是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，有清熱解毒、滋補(bǔ)養(yǎng)陰降火、消炎減輕疼痛等功效［3］。在現(xiàn)代中藥研究中，金線蓮多用于糖尿病、高脂血、乙型肝炎等疾病的治療［4］。隨著對(duì)金線蓮研究的不斷加深，金線蓮的優(yōu)良治療效果日益得到矚目，受到廣大民眾的青睞，具有廣闊的開發(fā)前景。

金線蓮苷 (kinsenoside)是金線蓮的特質(zhì)性成分，為葡萄糖與五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳以氧苷鍵形式連接形成的苷［5］，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該屬植物含金線蓮苷的水提物有保護(hù)肝臟、降血脂、降低血糖、止痛、消炎等廣泛的藥理活性［6-7］。因此本研究主要是對(duì)金線蓮中的金線蓮苷類成分進(jìn)行提取純化，并對(duì)金線蓮苷進(jìn)行定量分析研究，建立HPLC-ELSD測(cè)定方法。有少量文獻(xiàn)發(fā)表金線蓮苷的定量測(cè)定方法［8］，但是其檢測(cè)方法分離度不高，準(zhǔn)確性不是很好。

1 實(shí)驗(yàn)材料

美國戴安公司DIONEX P680高效液相色譜儀(P680型輸液泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Chromeleon色譜工作站);SEDEX 75型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (法國迪馬公司);Hypersil NH2色譜柱 (5 μm，4.6 mm ×250 mm);AB204-N型萬分之一電子分析天平 (美國METTLER TOLEDO公司);LC-350A型超聲波中藥處理機(jī) (山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司)［9］。

金線蓮藥材 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，經(jīng)中國科學(xué)院武漢植物研究所王映明教授鑒定)。金線蓮苷對(duì)照品為自制，純度經(jīng) TLC、HPLC、質(zhì)譜、熔點(diǎn)和旋光度測(cè)定等進(jìn)行純度鑒定，純度在98%以上，符合“中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用對(duì)照品研究的技術(shù)要求”［10］;金線蓮提取物樣品(自制，批號(hào)分別為20130401、20130502、20130503);乙腈為色譜純 (美國Tedia公司);水為超純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金線蓮提取物樣品制備 取干燥的金線蓮藥材，剪碎，加20倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h。將3次提取液合并，濃縮至無醇味，加入20倍水，攪勻，靜置過夜，離心，過濾，得上清液。將上清液濃縮至比重為1.3左右，上DM131大孔吸附樹脂，用水洗脫，收集流出液，減壓濃縮，真空干燥即得金線蓮提取物。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Hypersil NH2色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為乙腈-水 (92 ∶8)［11］;體積流量為1.0 mL/min;柱溫30℃;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器霧化室溫度為40℃;載氣為高純氮?dú)?，氮?dú)鈮毫?50 kPa［12］;信號(hào)值為7。理論塔板數(shù)按金線蓮苷峰計(jì)算不低于10000，系統(tǒng)適用性良好。

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取金線蓮苷對(duì)照品適量，加甲醇制得每1 mL含0.5 mg的金線蓮苷，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，精密稱取約0.2 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL水，密塞，超聲處理30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取1 mL續(xù)濾液，置于10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 空白溶劑樣品溶液的制備 精密量取1 mL水，置于10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，本方法專屬性較好，溶劑無干擾，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液 (金線蓮苷 0.524 mg/mL)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值 (mAu×min)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo) (Y)，對(duì)照品的進(jìn)樣量 (μg)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo) (X)進(jìn)行線性回歸，得金線蓮苷回歸方程為Y=0.7527X－1.2561(r=0.99993)，線性范圍為 0.524 ～5.24 μg。

2.6 檢測(cè)限和定量限考察 量取對(duì)照品溶液，逐步稀釋成一系列濃度由高到低的對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得檢測(cè)限 (S/N=3)和定量限 (S/N=10)分別為0.1514、0.5073 μg。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of kinsenoside reference substances，sample and negative sample

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果金線蓮苷RSD為1.56%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件，分別于0、1、2、3、4、6 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果金線蓮苷峰面積的RSD為1.87%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。當(dāng)供試品溶液超過6 h進(jìn)樣后，峰面積的RSD值超過2%，達(dá)不到穩(wěn)定性試驗(yàn)的要求。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品 (批號(hào)20130401)0.2 g，平行稱取6份，按“2.3.2”項(xiàng)下處理，按“2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果金線蓮苷含有量為48.03%，RSD為1.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含有量的樣品 (批號(hào)20130401)0.1 g，平行稱取6份，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液10 mL(金線蓮苷4.84 mg/mL，溶劑為水)，加水至刻度，密塞，超聲處理30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。按“2.2”項(xiàng)色譜條件，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.11 樣品測(cè)定 取3批樣品，按上述“2.2”項(xiàng)色譜條件及方法測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=5)Tab.2 Results of determination(n=5)

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇 關(guān)于金線蓮苷的成分定量測(cè)定的文獻(xiàn)比較少，且都是采用的高效液相色譜與紫外檢測(cè)器聯(lián)用［8，13］，作者也嘗試按照文獻(xiàn)的方法來測(cè)定金線蓮苷的量，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)金線蓮苷的紫外吸收度非常小，而雜質(zhì)的吸收很強(qiáng)，因此用紫外檢測(cè)將無法正確測(cè)定金線蓮苷的量。且采用C18柱時(shí)，金線蓮苷極性較大，出峰時(shí)間過早，干擾較大，要達(dá)到分離度1.5的完全分離較困難，不適合作為藥品的定量測(cè)定方法。后期研究發(fā)現(xiàn)采用HPLCELSD法，并且使用氨基柱，能夠針對(duì)性地檢測(cè)金線蓮苷的量，金線蓮苷出峰時(shí)間比較適當(dāng)，分離度比較好，基本不存在干擾，檢測(cè)方法靈敏度較高。

3.2 樣品提取純化方式的選擇 根據(jù)金線蓮苷結(jié)構(gòu)得知，金線蓮苷是一個(gè)五元環(huán)內(nèi)酯與葡萄糖連接形成的苷類。所以金線蓮苷極性偏大，易溶于水、乙醇和甲醇，但是由于金線蓮苷的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)和苷類結(jié)構(gòu)的影響，金線蓮苷在酸堿性溶劑環(huán)境下不穩(wěn)定，易開環(huán)分解。所以在前期對(duì)金線蓮藥材采取兩種提取純化方式，一種是水提醇沉，一種是醇提水沉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醇提水沉效果要好于水提醇沉，可能跟金線蓮苷在水環(huán)境下易分解有關(guān)系。

3.3 測(cè)定時(shí)，由于金線蓮苷的不穩(wěn)定性，所以供試品溶液在超過6 h后進(jìn)針，峰面積的RSD超過2%。因此供試品溶液需要在配制的6 h內(nèi)進(jìn)針，才能準(zhǔn)確地進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。另外，對(duì)流動(dòng)相的組成和比例進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提高乙腈在流動(dòng)相中的比例時(shí)，金線蓮苷的出峰時(shí)間推后，能夠跟溶劑峰分離開來，但是當(dāng)乙腈比例達(dá)到95%時(shí)，金線蓮苷不出峰，因此要選擇合適的流動(dòng)相組成和比例。

［1］張紅艷，潘 馨.金線蓮化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2009，21(1):82-84.

［2］蔡金艷，張勇慧，吳繼洲.藥王金線蓮揮發(fā)油及石油醚提取物的氣相色譜-質(zhì)譜-數(shù)據(jù)系統(tǒng)聯(lián)用測(cè)定［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(7):1550-1552.

［3］唐 菲，張小瓊，徐江濤，等.金線蓮降血糖活性部位的篩選［J］.中草藥，2011，42(2):340-342.

［4］何春年，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮的化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(3):259-262.

［5］張勇慧.金線蓮苷及其衍生物及制備方法和用途:中國，CN200810236824.3［P］.2008-12-12.

［6］Cui S C，Yu J，Zhang X H，et al.Antihyperglycemic and antioxidant activity of water extract from Anoectochilus roxburghii in experimental diabetes ［J］.Exp Toxicol Pathol，2013，65(5):485-488.

［7］張錦文，唐 菲，張小瓊，等.高效液相色譜法測(cè)定金線蓮中金線蓮苷的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(4):261-263.

［8］蔡金艷.金線蓮降血糖活性成分及作用機(jī)制的研究［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2006.

［9］萬 婷，熊富良，高文天，等.骨康膠囊的質(zhì)量控制研究［J］.中成藥，2012，34(6):1096-1099.

［10］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［11］GB/T15038-2006，葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［12］季秀美，舒 展，徐瓊明，等.HPLC-ELSD法測(cè)定白頭翁總皂苷堿水解產(chǎn)物中8種皂苷［J］.中草藥，2013，44(11):1416-1419.

［13］Wu J B，Lin W L，Hsieh C C，et al.The hepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilus formosanus［J］.Wiley Inter Science，2007，24(21):58-61.