津力達(dá)對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂質(zhì)沉積及線粒體功能的影響

臧莎莎，劉頤軒，宋光耀，王 超

(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050017;2.河北省人民醫(yī)院，河北石家莊 050051)

2型糖尿病的重要特征是胰島素抵抗 (IR)［1］。骨骼肌IR的發(fā)生在整個(gè)機(jī)體IR中占重要地位。而骨骼肌脂質(zhì)沉積是誘導(dǎo)骨骼肌IR的主要原因［2］。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)代謝異常尤其是發(fā)生2型糖尿病時(shí)，線粒體功能往往已經(jīng)受損［3］，出現(xiàn)線粒體脂肪酸氧化的減少及骨骼肌脂質(zhì)沉積。降糖中成藥津力達(dá)能夠降低患者血糖、膽固醇、甘油三酯水平，改善IR，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究從骨骼肌線粒體功能的改變及脂質(zhì)沉積角度探討津力達(dá)改善IR的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 中成藥津力達(dá)由河北以嶺藥業(yè)提供，國藥準(zhǔn)字Z 20050845;津力達(dá)為黃棕色顆粒劑，氣微香，味微苦;藥用復(fù)合膜包裝，每袋裝9 g，9袋/盒;將津力達(dá)顆粒研磨成粉末，用0.5%的羥甲基纖維素鈉配制成為25%的津力達(dá)溶液灌胃。鹽酸吡格列酮片，由日本武田制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格15 mg/片，批號(hào)149A;鹽酸吡格列酮研磨成為粉末后用0.5%的羥甲基纖維素鈉配制成0.1%的溶液灌胃。大鼠血清胰島素及游離脂肪酸(FFA)ELISA試劑盒、骨骼肌甘油三酯 (TG)測(cè)試盒、骨骼肌FFA測(cè)試盒、骨骼肌長鏈脂酰輔酶A(LCACoA)ELISA試劑盒均購自南京建成生物試劑公司;肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子 (PGC-1α)抗體購于Santa Cruz公司，β-actin抗體及辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗購自ProteinTech Group公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量 (140±20)g，購自中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，許可證號(hào)scxk(京)2009-0017，動(dòng)物合格證號(hào):0270141。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼料 基礎(chǔ)飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，熱量組成為碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白質(zhì)24.2%，總熱量為348 kcal/100 g;自制高脂飼料熱量組成為碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白質(zhì)占20.1%，總熱量為501 kcal/100 g。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，12只予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，24只予高脂喂養(yǎng)。6周后每組各取6只行正葡萄糖高胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)判斷IR模型造模成功。基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的剩余6只繼續(xù)予基礎(chǔ)飼料作為正常對(duì)照組;高脂喂養(yǎng)造模成功的18只進(jìn)一步分組，高脂對(duì)照組，吡格列酮治療組給予 4.5 mg/(kg·d)，津力達(dá)治療組給予1.5 g/(kg·d)，吡格列酮與津力達(dá)溶液用0.5%的羥甲基纖維素鈉配制。津力達(dá)及吡格列酮給藥劑量均采用體表面積折算法將臨床用藥劑量等效折算為大鼠用藥劑量。每日灌胃給藥1次，正常、高脂對(duì)照組予同體積生理鹽水灌胃，每周測(cè)量體質(zhì)量及統(tǒng)計(jì)攝食量。灌胃第8周，腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，留取血清;留取股四頭肌標(biāo)本，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn) 60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，行右頸動(dòng)脈、右頸靜脈插管術(shù)，導(dǎo)管經(jīng)皮下由耳后引出并固定，用100 IU/mL肝素封管，結(jié)扎固定于頸后皮膚。插管術(shù)后3～5 d，待大鼠恢復(fù)體質(zhì)量，禁食12 h過夜，次日在特制的鼠籠中行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。測(cè)定基礎(chǔ)血糖值后，4 mU/(kg·min)勻速輸注胰島素，使大鼠體內(nèi)的胰島素水平迅速升高。其后每10 min測(cè)定一次靜脈血糖，輸注并調(diào)整30%葡萄糖溶液的輸注率，使維持血糖在 (5±0.5)mmol/L，連續(xù)3次以上血糖在上述范圍即表明達(dá)到穩(wěn)態(tài)，取穩(wěn)態(tài)下5～6次葡萄糖輸注率 (GIR)的平均值作為大鼠胰島素敏感性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.4.3 血液生化指標(biāo)、骨骼肌 TG、FFA、LCACoA水平測(cè)定 灌胃第8周空腹取血，用快速血糖測(cè)定儀測(cè)定血糖，并分離血清于-80℃保存，同批測(cè)定胰島素、TG、血清膽固醇 (TC)和FFA。血清胰島素、FFA用ELISA試劑盒檢測(cè)，血清甘油三酯和總膽固醇采用Beckman X20自動(dòng)生化儀測(cè)定;骨骼肌TG經(jīng)無水乙醇抽提后用TG試劑盒測(cè)定，F(xiàn)FA采用銅顯色法測(cè)定，LCACoA使用ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.4.4 骨骼肌 PGC-1α和CPT1蛋白表達(dá) 采用Western-blotting方法測(cè)定。冷凍的骨骼肌組織稱質(zhì)量，加入組織裂解液提取蛋白并定量。取30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉液室溫封閉 4 h，CPT1、PGC-1α、β-actin一抗4℃搖床過夜，洗膜后再加入辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒暗室顯影。

1.4.5 RT-PCR檢測(cè) 用Trizol法提取小鼠骨骼肌總RNA，RT-PCR采用Syber Green I GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒在ABI PRISM 7300 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，隨后95℃變性15 s 40個(gè)循環(huán)，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。Pgc1α正向引物5'-AAGACCAGGAAATCCGAGC-3'，反向引物5'-TTGCCATCCCGTAGTTCAC-3';Cpt1正向引物5'-CCAAACATCACTGCCCAA-3'，反向引物5'-GGAAATAGGCTTCGTCATCC-3';Nrf1正向引物5'-AGACACGGTTGCTTCGGAA-3'，反向引物5'-CGCACCACATTCTCCAAAG-3';CoxⅣ正向引物5'-TCGCTGAGATGAACAAGGG-3'，反向引物5'-AGTGAAGCCGATGAAGAACA-3';Acadm正向引物 5'-TGACGGAGCAGCAGAAAGAG-3'，反向引物5'-TTGATGAGAGGGAACGGGT-3';Pparα正向引物5'-GGTCCGATTCTTCCACTGCT-3'，反向引物5'-GGTAACCTGGTCATTCAAGTC-3';Pparγ 正向引物 5'-CCACCAACTTCGGAATCAG-3'，反向引物5'-GATGTCAAAGGAATGGGAGTG-3';β-actin正向引物 5'-TGTGATGGTGGGTATGGGT-3'，反向引物5'-AGGATGCCTCTCTTGCTCTG-3'。反應(yīng)結(jié)束后，按照各反應(yīng)孔Ct值，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計(jì)算各樣品目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 電鏡觀察 透射電鏡于河北醫(yī)科大學(xué)觀察。切取少量肌組織，用銳利眼科剪剪成 (2 mm×2 mm×2 mm)左右的組織方塊，浸泡于2.5%的戊二醛，1%鋨酸固定，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋，制備成1 μm的超薄切片，最后在HITACHI H7500型透射電鏡下觀察并攝片。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用spss 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，組間比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析。以 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量及血液生化指標(biāo)的比較 與正常組相比，高脂組大鼠體質(zhì)量明顯增加 (P＜0.05)，津力達(dá)及吡格列酮組與高脂組比較體質(zhì)量降低(P＜0.05)。每日平均攝入熱量津力達(dá)、吡格列酮組與高脂組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。高脂組空腹血糖、胰島素、TG、TC、FFA均高于正常組，除TC外都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05);津力達(dá)及吡格列酮組空腹血糖高于正常組，低于高脂組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);津力達(dá)及吡格列酮組空腹胰島素、FFA較高脂組降低 (P＜0.05)，與正常組無差別;津力達(dá)能夠顯著降低TG，TC(P＜0.05)，吡格列酮組只能降低TG水平 (P＜0.05)。見表1。

2.2 胰島素敏感性評(píng)價(jià) 高脂組GIR明顯低于正常組 (P＜0.05)，津力達(dá)及吡格列酮組GIR較高脂組升高 (P＜0.05)，與正常組無差別。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、日均攝食、血糖、胰島素、血脂、GIR比較 ()Tab.1 Body weight，energy food intake，blood glucose，insulin，lipid and GIR among groups()

表1 各組大鼠體質(zhì)量、日均攝食、血糖、胰島素、血脂、GIR比較 ()Tab.1 Body weight，energy food intake，blood glucose，insulin，lipid and GIR among groups()

注:與高脂組相比，*P＜0.05;與正常組相比，#P＜0.05

組別 體質(zhì)量/g 攝食/(kcal·day-1)血糖/(mmol·L-1)胰島素/(mU·L-1)GIR/% TG/(mmol·L-1)FFA/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)正常組 471.50±4.53* 87.32±6.01* 4.42±0.16* 11.60±1.17* 27.83±1.15* 0.37±0.03* 0.64±0.05*1.04±0.07高脂組 644.83±15.77# 117.06±6.25# 7.23±0.25# 27.22±1.55# 14.58±0.44# 0.52±0.03# 1.40±0.08# 1.15±0.05吡格列酮組 539.00±10.55*#110.34±7.92 4.85±0.20* 16.39±1.55* 27.53±0.40* 0.23±0.03*#0.76±0.05* 1.01±0.06津力達(dá)組 540.67±17.43*#101.59±5.05 5.79±0.24*# 15.38±1.56* 29.10±0.82* 0.15±0.01*#0.76±0.06* 0.75±0.05*

2.3 各組大鼠骨骼肌TG、FFA、LCACoA水平比較 高脂組骨骼肌TG、FFA、LCACoA水平均高于正常組 (P＜0.05)，津力達(dá)及吡格列酮組 TG、FFA、LCACoA水平較高脂組明顯降低 (P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌TG、FFA、LCACoA比較 ()Tab.2 TG、FFA、LCACoA in skeletal muscle among groups()

表2 各組大鼠骨骼肌TG、FFA、LCACoA比較 ()Tab.2 TG、FFA、LCACoA in skeletal muscle among groups()

注:與高脂組比較，*P＜0.05;與正常組比較，#P＜0.05

組別TG/(mmol·g-1)FFA/(mmol·g-1)LCACoA/(nmol·g-1)正常組 0.07±0.01* 77.20±6.41* 3.82±0.26*高脂組 0.26±0.01# 150.06±6.36# 7.23±0.34#吡格列酮組 0.07±0.01* 64.80±6.16* 4.68±0.21*#津力達(dá)組 0.07±0.01* 79.59±6.62* 5.00±0.13*#

2.4 各組大鼠線粒體基因的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)了線粒體Pgc1α，核呼吸因子1(Nrf1)，細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅳ (CoxⅣ)的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了線粒體氧化脂肪酸基因包括肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(Cpt1)、乙酰輔酶A脫氫酶 (Acadm)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(Pparα)和Pparγ的表達(dá)。與正常組比較，高脂組上述基因mRNA的表達(dá)明顯下調(diào) (P＜0.05)，津力達(dá)與吡格列酮均上調(diào)了Pgc1α、 Cpt1、 Acadm、 Pparα 及 Pparγ (P ＜0.05)，均未改變Nrf1的表達(dá) (P＞0.05)。津力達(dá)上調(diào)了CoxⅣ的表達(dá)，而吡格列酮未能上調(diào)其表達(dá)。見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌線粒體基因的比較 ()Tab.3 mRNA levels for multiple genes involved in mitochondrial function and fat oxidation in skeletal muscle among groups()

表3 各組大鼠骨骼肌線粒體基因的比較 ()Tab.3 mRNA levels for multiple genes involved in mitochondrial function and fat oxidation in skeletal muscle among groups()

注:與高脂組比較，*P＜0.05;與正常組比較，#P＜0.05

組別 Pgc1α Nrf1 CoxⅣ Cpt1 Acadm Pparα Pparγ正常組 1.32±0.08* 0.89±0.06* 1.35±0.09* 1.26±0.05* 1.67±0.19* 1.06±0.06* 1.59±0.08*高脂組 0.49±0.07# 0.47±0.04# 0.72±0.09# 0.49±0.05# 0.62±0.09# 0.39±0.04# 0.59±0.07#吡格列酮組 0.88±0.10*# 0.62±0.04# 0.75±0.06# 1.07±0.05*# 1.22±0.11*# 1.00±0.07* 1.47±0.07*津力達(dá)組 0.95±0.06*# 0.62±0.05# 1.12±0.12* 0.96±0.08*# 1.28±0.16*# 0.78±0.04*# 1.29±0.08*#

2.5 各組大鼠骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白表達(dá)大鼠骨骼肌組織PGC-1α和CPT1蛋白以其與β-actin的比值表示，結(jié)果顯示骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白高脂組低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，津力達(dá)及吡格列酮組較高脂組蛋白表達(dá)升高 (P＜0.05)。見圖1、表4。

表4 骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白相對(duì)表達(dá)量 ()Tab.4 Protein relative expression of PGC-1α and CPT1 in skeletal muscle()

表4 骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白相對(duì)表達(dá)量 ()Tab.4 Protein relative expression of PGC-1α and CPT1 in skeletal muscle()

注:與高脂組比較，*P＜0.05;與正常組比較，#P＜0.05

CPT1正常組 1* 1組別 PGC-1α*高脂組 0.46±0.05# 0.43±0.01#吡格列酮組 0.79±0.05*# 0.79±0.07*#津力達(dá)組 0.81±0.06*# 0.67±0.09*#

圖1 骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白表達(dá)比較Fig.1 Protein expression ofPGC-1α andCPT1in skeletal muscle

2.6 電鏡觀察 正常組大鼠骨骼肌組織線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿內(nèi)無脂滴，線粒體膜、嵴結(jié)構(gòu)完整，嵴為隔板狀，基質(zhì)均勻，與線粒體長軸垂直，排列規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊。高脂組大鼠骨骼肌組織脂滴較多，線粒體腫脹，線粒體嵴變少變短，部分或全部脊和膜融合消失，甚至出現(xiàn)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，津力達(dá)及吡格列酮干預(yù)后脂滴明顯減少，線粒體腫脹減輕。見圖2。

圖2 電鏡下線粒體形態(tài)觀察Fig.2 Mitochondria morphology was determined by electron microscopy

3 討論

胰島素抵抗 (IR)指外周組織及靶器官對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低［1］，是肥胖和2型糖尿病的病理基礎(chǔ)。雖然引起IR的具體機(jī)制仍不明確，但是近年來人們認(rèn)為脂質(zhì)剩余可能是其分子基礎(chǔ)之一。

骨骼肌組織是全身脂肪酸利用的主要場(chǎng)所，骨骼肌IR的發(fā)生在整個(gè)機(jī)體IR中占重要地位。高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)IR的發(fā)生，同時(shí)與細(xì)胞脂代謝異常密切相關(guān)，當(dāng)脂肪酸的攝入超出骨骼肌自身氧化能力時(shí)通常會(huì)導(dǎo)致骨骼肌脂質(zhì)堆積，如TG，F(xiàn)FA，LCACoA的堆積，從而損害胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路［4］，最終誘導(dǎo)骨骼肌乃至全身IR的發(fā)生。

線粒體是調(diào)控代謝的重要細(xì)胞器。線粒體內(nèi)膜上有呼吸鏈酶系、ATP合成酶系及肉毒堿?；D(zhuǎn)移酶等，基質(zhì)中則存在三羧酸循環(huán)酶類、脂肪酸氧化酶類和蛋白質(zhì)、核酸合成酶類等，外膜中酶的量相對(duì)較少。線粒體主要功能是進(jìn)行氧化磷酸化合成ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供直接能量，同時(shí)也是糖脂代謝的場(chǎng)所。目前普遍認(rèn)為機(jī)體的IR狀態(tài)與能量過度攝入，線粒體脂質(zhì)代謝超負(fù)荷，導(dǎo)致線粒體功能障礙有關(guān)。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)IR尤其是發(fā)生2型糖尿病時(shí)，線粒體功能往往已經(jīng)受損，因此通常出現(xiàn)線粒體脂肪酸氧化的減少及脂質(zhì)異位積聚［5-6］。IR患者通常伴隨編碼線粒體蛋白的核基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(Pgc1α)，調(diào)節(jié)線粒體生物合成及功能的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄共激活因子，表達(dá)明顯下調(diào)［7］。其中線粒體內(nèi)膜上的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)，將長鏈脂酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化，是β氧化的限速環(huán)節(jié)，對(duì)骨骼肌乃至整個(gè)機(jī)體脂肪酸的氧化發(fā)揮重要作用。高脂飲食誘導(dǎo)的IR大鼠通常伴隨CPT1 的表達(dá)下調(diào)［8］。

津力達(dá)是由人參、黃精、蒼術(shù) (炒)、苦參、麥冬、地黃等十幾味中藥制成，具有益氣養(yǎng)陰、健脾運(yùn)津的功效。臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)它能夠降低四氧嘧啶和腎上腺素所誘發(fā)大鼠的高血糖，調(diào)節(jié)糖耐量［9］，臨床上主要用于IR及糖尿病的治療，但是其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究選用吡格列酮，PPARγ激動(dòng)劑，作為陽性對(duì)照藥來探討津力達(dá)改善IR的作用機(jī)制。

津力達(dá)灌胃8周后明顯改善了高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠IR:空腹血糖、胰島素、血TC、TG、FFA等均得到改善;高脂飲食后骨骼肌脂質(zhì) (TG、FFA、LCACoA)發(fā)生沉積，津力達(dá)及對(duì)照藥物吡格列酮干預(yù)后脂質(zhì)沉積明顯減輕。為進(jìn)一步探究其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了津力達(dá)對(duì)骨骼肌線粒體基因Pgc1α、Nrf1、CoxⅣ 及線粒體氧化脂肪酸基因 Cpt1、Acadm、Pparα和Pparγ表達(dá)的影響，同時(shí)檢測(cè)了骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白的表達(dá)。高脂飲食后線粒體基因及PGC-1α、CPT1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，津力達(dá)干預(yù)后明顯增加了上述基因及蛋白的表達(dá):表達(dá)上調(diào)的CPT1將LCACoA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，線粒體基因尤其是氧化脂肪酸基因表達(dá)的上調(diào)增加了線粒體氧化脂肪酸能力，從而對(duì)進(jìn)入線粒體的脂質(zhì)進(jìn)行充分地β氧化，減少了骨骼肌脂質(zhì)沉積，改善了IR。與津力達(dá)不同，吡格列酮未能上調(diào)CoxⅣ基因的表達(dá)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠骨骼肌線粒體基因表達(dá)下調(diào)、功能減低，骨骼肌脂質(zhì)TG、FFA、LCACoA水平增加，發(fā)生胰島素抵抗。津力達(dá)干預(yù)之后上調(diào)了骨骼肌線粒體基因的表達(dá)，增強(qiáng)了線粒體功能及脂肪酸β氧化，最終減少了骨骼肌脂質(zhì)沉積，改善了胰島素抵抗。

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