熱休克蛋白90α在女性巨乳癥中的表達及意義

徐 晨, 栗 勇, 王 鈉, 雷 鳴

實驗研究

熱休克蛋白90α在女性巨乳癥中的表達及意義

徐 晨, 栗 勇, 王 鈉, 雷 鳴

目的探討巨乳中的熱休克蛋白90α的表達及定位，并分析其在巨乳癥發(fā)病中的作用機制。方法采用免疫組化法測定40例巨乳乳腺組織及40例正常體積乳腺組織中熱休克蛋白90α的表達及定位。結(jié)果熱休克蛋白90α在巨乳乳腺組織中的表達率為87.5%，在正常體積乳房乳腺組織中的表達率為22.5%。兩者差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論熱休克蛋白90α在巨乳癥乳腺組織中呈高表達，提示熱休克蛋白90α可能參與了巨乳癥的發(fā)生及發(fā)展。

巨乳癥; 熱休克蛋白90α; 組織增殖

巨乳癥又稱乳房肥大癥，是指女性乳房過度發(fā)育，腺體及脂肪組織過度增生，體積超常，與軀體明顯失調(diào)[1]。而乳房大小的定義標準因種族、地域、文化以及生活習慣而不同，目前還沒有完全統(tǒng)一的認識，巨乳癥的機制目前還不完全清楚。有研究表明，巨乳癥乳腺組織的病理改變以乳腺小葉上皮組織及小葉間質(zhì)纖維組織增生為主[2]，因此，巨乳癥發(fā)病過程中最重要的細胞活動之一就是增殖。目前，參與細胞增殖的各種調(diào)控因子有很多，針對這些因子的研究，會對巨乳癥的治療提供新的方向。熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α， Hsp 90α)是細胞受應(yīng)激原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白。有研究表明，Hsp 90α可促進細胞遷移，并通過調(diào)節(jié)細胞周期促進細胞增殖[3]。有大量研究表明，Hsp90表達異常與乳腺惡性腫瘤、消化道癌、肺癌、腎癌、膀胱癌等有關(guān)。自2012年2月至2013年7月，筆者采用免疫組化法檢測Hsp90在巨乳中的表達，并與正常體積乳房乳腺組織中Hsp90表達做對比，探討巨乳癥發(fā)病機制。

1 臨床資料

選擇第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院整形外科40例單側(cè)乳房總量在600 ml以上、單側(cè)乳房切除總量在300 g以上的女性患者作為實驗組。年齡19～61歲，平均31歲。平均體質(zhì)量指數(shù)為23.25。所有患者均簽署知情同意書。為進一步分析研究結(jié)果，我們將實驗組又以是否哺乳及單側(cè)乳房是否大于1000 ml進行分組。選擇我科40例原發(fā)性乳房下垂行乳房懸吊的患者作為對照組,術(shù)中于切除組織中取少量樣本。年齡20～44歲，平均28歲，平均體質(zhì)量指數(shù)22.55；單側(cè)乳房體積在250～350 ml，250～350 ml[4]。其年齡、體質(zhì)量指數(shù)與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學意義(采用兩樣本t檢驗，P>0.05)。乳房體積的測量方法及乳房體積計算公式與王鈉等[4]采用的方法相同。計算公式：乳房體積=33.5×PP+37.7×FP-1305(測量時患者取站立位，PP為乳房底部的周長，P為定位乳房下皺壁中點在乳房前表面的投影點，測量P點至乳房下皺壁的直線距離為FP)。所有患者經(jīng)病理診斷和病史回顧有下列情況之一者被排除在本研究之外：①有乳腺纖維瘤病史；②2個月內(nèi)有服用雌激素類藥物史；③有乳腺癌家族史或病史；④切除組織標本中有囊腫、積液或積乳；⑤月經(jīng)周期不規(guī)律；⑥有妊娠史；⑦乳頭溢液；⑧組織病理學檢查有非典型增生。所有手術(shù)均避開月經(jīng)期，安排在經(jīng)期后第2～3 周。

2 方法

2.1 主要試劑 兔抗人Hsp90多克隆抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(Sp)免疫組織化學試劑盒(美國CHEMICON公司)。

2.2 具體操作 取術(shù)中切取的組織標本5～10 g，用10%中性緩沖福爾馬林固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進行Sp免疫組織化學法檢測。用已知Hsp90表達陽性的乳腺癌組織切片(圖1)作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。Sp免疫組化法參照說明進行。

2.3 結(jié)果判斷 顯微鏡下，細胞核或細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀、背景無明顯著色為陽性，陰性無棕黃色顆粒沉淀。40倍下，每張切片隨機取5個視野，每個視野以陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比作為標準，取平均值。陰性<10%(-),輕度陽性11%～25%(+)，中度陽性26%～75%()，強陽性()76%～100%。

2.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，兩組的Hsp90陽性率比較用χ2檢驗。實驗組中各因素的進一步比較采用費歇爾精確概率檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

實驗組中，Hsp 90α呈棕黃色顆粒沉淀，均在增生小葉上皮細胞及導(dǎo)管上皮細胞的細胞核、細胞漿中表達，陽性表達率為87.5%(圖2)。對照組中，Hsp 90α呈微弱表達，陽性表達率僅為22.5%(圖3)。兩組中Hsp 90α表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組按是否哺乳分成的兩組，Hsp 90α的表達差異無顯著的統(tǒng)計學意義(P>0.01)。按單側(cè)乳房體積是否>1000 ml分成的兩組，Hsp 90α表達差異無顯著的統(tǒng)計學意義(P>0.01)，見表1。

4 討論

目前巨乳癥的發(fā)病機制尚不清楚，有學者認為,其與體內(nèi)雌激素分泌增多等有關(guān)，但大多數(shù)巨乳癥患者外周血清雌激素處于正常水平，也有學者認為，巨乳癥與乳腺內(nèi)雌激素受體增多有關(guān)[5]。王鈉等[4]發(fā)現(xiàn),雌激素受體γ在巨乳癥組織中表達率(83.52%)明顯高于正常體積乳房組織(25.94%)，認為在巨乳癥中，雌激素受體γ蛋白的表達增高。韓文雅等[6]采用免疫組化Sp法分別測定10例原發(fā)性小乳癥女性和6例青春期巨乳女性以及10例妊娠后巨乳女性乳腺組織中雌激素受體(estrogen receptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor, PR)的表達發(fā)現(xiàn)，ER在原發(fā)性小乳癥女性乳腺組織中與巨乳患者(青春期巨乳和妊娠后巨乳)乳腺組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);PR在原發(fā)性小乳癥女性乳腺組織中與青春期巨乳患者乳腺組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但PR在青春期巨乳中與妊娠后巨乳乳腺組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，故認為青春期巨乳的發(fā)生可能與乳腺組織中ER的表達水平相關(guān);而妊娠后巨乳的發(fā)生可能與乳腺組織中ER、PR的表達水平均相關(guān)。但眾多學者對巨乳癥的發(fā)病機制仍有爭議。張芾男等[7]報道，在青春期巨乳癥乳腺組織和原發(fā)性小乳癥乳腺組織中,細胞周期蛋白D1的陽性表達率分別為83.33%和16.67%，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，認為細胞周期蛋白D1在青春期巨乳癥乳腺組織中的表達水平明顯高于原發(fā)性小乳癥乳腺組織。以上觀點都有大量臨床實驗支持，但并都不是導(dǎo)致巨乳癥乳腺組織增殖的唯一因素，巨乳癥的具體增殖機制仍在探索。病理學研究表明，巨乳癥乳腺組織的病理改變以乳腺小葉上皮組織及小葉間質(zhì)纖維組織增生為主[2]。由此可以推論，細胞增殖應(yīng)是巨乳癥發(fā)病過程中最重要的細胞活動之一，而參與細胞增殖調(diào)控的各種因子有可能成為巨乳癥形成的主要或干預(yù)性治療的靶點。目前有大量實驗表明，Hsp 90α在乳腺癌、胃癌等惡性增殖組織中呈高表達。但Hsp 90α是否參與了巨乳癥中良性乳腺組織的增殖，目前還未見報道。

圖1 在乳腺癌組織中Hsp 90α高表達 a.×10 b.×40圖2 巨乳癥乳腺組織中Hsp 90α在乳腺小葉及導(dǎo)管上皮細胞的細胞核、細胞漿呈陽性表達 a.×10 b.×40圖3 正常乳腺中Hsp 90α低表達 a.×10 b.×40

Fig1 Strong expression of Hsp 90α in breast cancer tissue. a. ×10. b.×40.Fig2 Positive expression of Hsp 90α in the nucleus and cytoplasm of ducts and lobules in the mammary hypertrophy breast tissues. a. ×10. b. ×40.Fig3 Weak expression of Hsp 90α in normal breast tissue. a. ×10. b. ×40.

表1 Hsp 90α的表達與巨乳癥之間的關(guān)系

Tab1 Relationship between the mammary hypertrophy and expression of Hsp 90α

項目正常乳房組織肥大乳房組織哺乳因素有無體積大小>1000ml<1000mlN40328319-313131+54142?482102?0174144

機體在應(yīng)激情況下會引起熱休克蛋白的誘導(dǎo)表達[8]。按照分子量大小，熱休克蛋白分為六大家族，即Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60，Hsp40，還有小分子熱休克蛋白及泛素[9]。熱休克蛋白通常與具有不同功能的多種蛋白質(zhì)在細胞中形成復(fù)合體調(diào)節(jié)細胞的活性及功能，但又不參與靶蛋白的組成，因此，熱休克蛋白又被認為是一種分子伴侶，或伴侶蛋白[10]。Hsp90是熱休克蛋白家族中最活躍的分子伴侶之一，根據(jù)是否含有谷氨酰胺豐富的片段分為Hsp 90α和Hsp90β，兩者同源性高達84%[11]。在病毒的轉(zhuǎn)化和化學誘導(dǎo)的腫瘤細胞以及愈合的創(chuàng)面中，Hsp 90α表達水平均明顯升高，而Hsp90β 基本不變[12]，Hsp90積極參與了細胞的浸潤和增殖、血管的形成，可見Hsp90在細胞的增殖方面起著重要作用。目前，已知Hsp90能與100多種目的分子結(jié)合，調(diào)節(jié)和維持細胞的發(fā)育、增殖和分化。有研究表明，Hsp90通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶A信號通路促進血管形成。也有研究表明在低氧等應(yīng)激條件下，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞分泌Hsp 90α至胞外，當這些Hsp 90α迅速聚集達到100 μM的閾值時，會促進細胞的遷移。Cheng等[13]研究表明，低密度脂蛋白相關(guān)受體蛋白1(lipoprotein receptor-related protein-1， LRP-1)可以調(diào)節(jié)Hsp 90α的表達。在正常細胞以及腫瘤細胞中，存在“低氧→Hsp 90α分泌→LRP-1→細胞遷移或浸潤”分泌途徑，正常細胞在應(yīng)激條件下,如熱休克、低氧等，分泌Hsp 90α，Hsp 90α通過調(diào)節(jié)因子HIF-1α與LRP-1受體結(jié)合后，Hsp 90α可以通過自分泌或旁分泌因子促進細胞遷移，從而促進組織的增殖[14]。Gronthos等[15]證實,Hsp 90α能夠促進創(chuàng)面愈合所需的角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞的遷移，且不受轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor3-β, TGF-β3)的影響。有實驗證明，乳腺癌腫瘤細胞表達HIF-1α→HIF-1α進核與HIF-1β結(jié)合形成二聚體→促使細胞分泌Hsp 90α→分泌的Hsp 90α與胞膜上受體CD91結(jié)合→增強細胞遷移和侵襲能力，促進腫瘤形成[16]。經(jīng)Hsp90反義脫氧寡核昔酸處理的腫瘤細胞不僅表現(xiàn)出生長抑制，而且誘導(dǎo)該細胞凋亡。由此推測，Hsp90作為一種重要的基因產(chǎn)物參與了惡性腫瘤細胞增殖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程[16]，因此，Hsp 90α在乳腺組織的惡性增生中具有一定作用。

本研究結(jié)果顯示，實驗組中Hsp 90α陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05),巨乳癥組陽性表達多見于細胞漿及部分細胞核，說明組織中Hsp 90α的表達增加與巨乳癥密切相關(guān)。為了進一步探討Hsp90在已哺乳乳腺組織和乳房肥大的乳腺組織中的表達是否有差異，我們將巨乳癥患者再依據(jù)哺乳史分為兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hsp 90α在兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，由此說明，哺乳因素對Hsp 90α在巨乳癥乳腺組織中的表達無影響。我們在將巨乳癥患者依據(jù)單側(cè)乳房體積是否大于1000 ml分為兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間Hsp 90α表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？梢娙榉糠蚀蟪潭葘sp 90α表達無影響，此結(jié)果的造成原因也可能與小于1000 ml的乳房肥大患者較少有關(guān)。

本實驗證實,Hsp 90α在巨乳癥乳腺組織中存在高表達，說明作為一種伴隨現(xiàn)象，Hsp 90α在巨乳中的表達是增高的，那么Hsp 90α是否參與了巨乳癥的發(fā)生和發(fā)展呢？Hsp 90α在癌組織中高表達，而在巨乳癥組織中也同樣高表達，同樣高表達為什么前者癌變而后者卻沒有？以上問題目前還不能得出結(jié)論。但已有體外實驗證實，用抑制劑格爾德霉素耗竭Hsp 90α可使表皮生長因子受到抑制，從而抑制腫瘤組織及正常組織的血管形成，抑制組織生長。因此，以Hsp 90α作為靶點做進一步地研究，對巨乳癥的治療及發(fā)病機制的探索具有參考意義。

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Expressionofheatshockprotein90αinmammaryhypertrophyanditssignificance

XUChen,LIYong,WANGNa,etal.
(DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospital,theFirstAffiliatedHospitalofFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ObjectiveTo investigate expressions of Hsp90α and its position, analyzing the mechanism of action in formation of mammary hypertrophy.MethodsTissues (80 samples) were collected from 40 patients with mammary hypertrophy and 40 patients with normal breast and the expression of Hsp90α and its position were determined by immunohistochemistry.ResultsThe protein level of Hsp90α was significantly increased in mammary hypertrophy tissues (87.5%) compared with that in normal tissues (22.5%).ConclusionHsp90α may plays an important role in the development of mammary hypertrophy.

Mammary hypertrophy; Heat shock protein 90α; Hyperblastosis

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.03.020

R655.8

A

1673-7040(2014)03-0185-04

2013-10-28)

710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 整形外科

徐 晨(1984-)，男，遼寧人，住院醫(yī)師，碩士.