富血小板血漿對(duì)人原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖的影響

楊玲玲， 劉曉燕

實(shí)驗(yàn)研究

富血小板血漿對(duì)人原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖的影響

楊玲玲， 劉曉燕

目的觀察富血小板血漿對(duì)人原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖的影響。方法脂肪組織及靜脈血來(lái)源于6例吸脂的女性患者，在無(wú)菌條件下，從脂肪組織中分離獲取含原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞的血管基質(zhì)成分；在吸取脂肪的同時(shí)，抽取等單位體積的靜脈血，離心制備獲得富血小板血漿。采用Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及輔助，吖啶橙-碘化丙啶染色法對(duì)血管基質(zhì)成分活細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；血液分析儀對(duì)富血小板血漿進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，兩組分別用含5%、10%、15%的富血小板血漿及含10%胎牛血清培養(yǎng)液干預(yù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)在24,48,72,96 h時(shí)，原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞的數(shù)量值。結(jié)果①本實(shí)驗(yàn)血管基質(zhì)成分成骨、成脂轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性；Mark檢測(cè)，第3代脂肪來(lái)源干細(xì)胞CD73、CD90為陽(yáng)性，CD45為陰性，逆推驗(yàn)證，可從血管基質(zhì)成分中，可獲取原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞；②通過(guò)血清離心法可獲得約平均全血4倍的血小板；③實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組在24,48,72,96 h時(shí)，ADSCs數(shù)量增多，密度增大，其中72，96 h時(shí)段中，不同濃度的富血小板血漿對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論富血小板血漿對(duì)體外培養(yǎng)的人原代脂肪來(lái)源干細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

富血小板血漿； 脂肪來(lái)源干細(xì)胞； 血管基質(zhì)成分

脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-drived stem cells, ADSCs)，主要來(lái)源于脂肪組織，已被證實(shí)可分化為多種成體細(xì)胞(脂肪、軟骨、骨、肌肉、神經(jīng)等)。脂肪組織在腹部、腰部及臀部獲取容易，且損傷小，但體外擴(kuò)增ADSCs培養(yǎng)至第3代時(shí)間較長(zhǎng)，給患者帶來(lái)不便，同時(shí)增加感染的概率。富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是全血離心后獲得的血小板濃縮物，富含多種生長(zhǎng)因子。自2012年2月至2013年9月，筆者以ADSCs作為種子細(xì)胞，觀察自體PRP對(duì)原代ADSCs增殖的影響，為提高ADSCs快速擴(kuò)增、分化及自體細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)(cell-assisted lipontransfer, CAL)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要試劑及來(lái)源

低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HYCLONE公司),胎牛血清、胰蛋白酶 、β-甘油磷酸鈉、維生素C(沈陽(yáng)博而美公司),Ⅰ型膠原酶 (美國(guó)INVITROGEN公司),CD45、CD90、CD73、HLA-DR、IgG1(美國(guó)BD公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津川貢公司)，注射用胰島素 (美國(guó)禮來(lái)公司)，吲哚美辛、IBMX、吖啶橙(acridine oran， AO) 染色劑、碘化丙啶(propidium iodide， PI)染色劑(美國(guó)SIGMA公司)，地塞米松(北京SCOLARBIE公司)，油紅O、茜素紅(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 儀器設(shè)備

負(fù)壓脂肪吸引器XYQ-2，專用吸脂針(側(cè)孔為2 mm×3 mm,北京科儀真燕山醫(yī)療技術(shù)有限公司)，超凈工作臺(tái) (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，恒溫孵箱(日本三洋公司)，低溫高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙鑫奧公司)，分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，熒光倒置顯微鏡(DFC425C,德國(guó)LECIA公司)，Cellometer活細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó) NEXOCELCOM公司)，恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，移液器(德國(guó)EPPENDORF公司)。

1.3 組織來(lái)源

所有組織均來(lái)源于沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院整形外科行腹部吸脂的6例健康女性。年齡25～40歲。脂肪組織取自吸脂患者廢棄的脂肪組織顆粒，平均脂肪抽吸物為150 ml。同時(shí)抽取等單位體積的靜脈血，平均10 ml。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ADSCs原代分離提取及計(jì)數(shù)

取吸脂術(shù)中吸出的脂質(zhì)部分150 ml，用生理鹽水沖洗3次，移至離心管中。加入0.1%等量膠原酶，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育消化45 min，每10 min振蕩1次，充分消化纖維組織和血管壁等物質(zhì)。用等量體積的完全培養(yǎng)基中和后，以1800 r/min離心5 min，離心物分為4層，即油脂層、脂肪層、液體層和細(xì)胞沉淀層。取離心后的細(xì)胞沉淀層，每管加入5 ml無(wú)菌生理鹽水，吹打成細(xì)胞懸液。用70目濾網(wǎng)過(guò)濾結(jié)締組織至新離心管中，制成5 ml細(xì)胞懸液。取新離心管，加入10 ml人用淋巴細(xì)胞分離液(與細(xì)胞懸液的體積比為2∶1)，將細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上層。平衡離心管后，2300 r/min離心10 min。吸出上層的液體棄掉，中間的單核樣細(xì)胞加到另一新的離心管中，加入無(wú)菌生理鹽水至50 ml，吹打混勻。平衡離心管，1800 r/min離心5 min，洗去淋巴細(xì)胞分離液。棄上清后，加入等量DMEM培養(yǎng)基重懸，制成含原代ADSCs的血管基質(zhì)成分(stromal vascular fraction cells, SVF)細(xì)胞懸液。搖勻，取0.1 ml細(xì)胞液進(jìn)行Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)，其余細(xì)胞沉淀，進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 PRP的制備及含量測(cè)定

將靜脈血分別置入裝有0.25 ml枸櫞酸鈉抗凝劑的3 ml采血管中，每管各采血2 ml，采集5管。采用二次離心法,1000 r/min離心15 min。離心后，管內(nèi)液體分為上清液層和紅細(xì)胞層。吸取上層血漿及其交界面下約2 mm的血小板，制成含血小板的細(xì)胞懸液，3000 r/min離心8 min，棄上層血漿，將剩余液體與激活劑(1000 U凝血酶與10%CaCl2的混合物)以9∶1混合，振蕩，4 ℃冰箱過(guò)夜。次日，血凝塊充分收縮后，1000 r/min離心10 min，吸取全部上清液，此上清液即為PRP，0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌，備用。同時(shí)進(jìn)行全血及PRP血小板計(jì)數(shù)，PRP血小板含量達(dá)到或超過(guò)全血的4倍左右，則為達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的PRP。用沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科血液分析儀進(jìn)行離心前及離心后的血小板計(jì)數(shù)。

2.3 PRP對(duì)原代ADSCs的干擾濃度分組與時(shí)段分組的體外增殖培養(yǎng)

將提取的SVF細(xì)胞以1×103/孔的密度接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組：5%PRP 10 μl+DMEM 190 μl+ADSCs 50 μl、10%PRP 20 μl+DMEM 180 μl+ADSCs 50 μl、15%PRP 30 μl+DMEM 170 μl+ADSCs 50 μl；對(duì)照組： 10%胎牛血清20 μl+DMEM 180 μl+ADSCs 50 μl。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h消化，搖勻，取0.1 ml細(xì)胞液進(jìn)行Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,輔助AO-PI檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)數(shù)后更換培養(yǎng)液。

2.4 Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及輔助A0-PI檢測(cè)PRP對(duì)ADSCs增殖的干擾

在濃度分組與時(shí)段分組中，用微量加樣槍取18 μlAO溶液和2 μl PI溶液在Eppendorf管內(nèi)混勻，再加入20 μl 細(xì)胞懸液的細(xì)胞樣本，將其混勻后取20 μl混合液于1 min內(nèi)加至Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)板的加樣室，每個(gè)細(xì)胞樣本測(cè)量3次。計(jì)算軟件獲取圖像，并分析細(xì)胞數(shù)量。

2.5 ADSCs鑒定

2.5.1 原代ADSCs轉(zhuǎn)化成脂 脂肪誘導(dǎo)DMEM培養(yǎng)基(1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰島素，200 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤, 10%胎牛血清)。調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每2、3 d換液1次。定向分化誘導(dǎo)14 d后，用油紅O染色定性觀察體外誘導(dǎo)分化的結(jié)果。

2.5.2 原代ADSCs轉(zhuǎn)化成骨 成骨誘導(dǎo)DMEM培養(yǎng)基(10 mmol/L、β-甘油磷酸鈉、10 mmo/L 地塞米松、新鮮制備的0.2 mmol/L維生素C，10%胎牛血清)。調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每2、3 d換液1次。定向分化誘導(dǎo)14 d后，用茜素紅定性觀察體外誘導(dǎo)分化的結(jié)果。

2.5.3 第3代ADSCs流式細(xì)胞儀鑒定 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，細(xì)胞融合度已達(dá)80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化，然后用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，將獲得細(xì)胞懸液以1000 r/min離心3 min。棄上清后，加入完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，分成6份分別裝于6個(gè)1.5 ml的Eppendorf管中，每管分別加入100 μl的細(xì)胞懸液。室溫避光條件下，分別加入抗人單克隆抗體，CD45、CD90、CD73、HLA-DR、IgG1，每種加入20 μl。避光靜置15 min，PBS洗滌以去除未結(jié)合的抗體，以1500 r/min離心5 min，加入PBS重懸，分別將重懸后的細(xì)胞移入流式檢測(cè)管中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果，CELLQUEST軟件處理并分析數(shù)據(jù)，計(jì)算各組細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率。

2.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)為計(jì)量數(shù)據(jù)，時(shí)間的分組與濃度分組的ADSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)采用均數(shù)方差分析比較，當(dāng)方差分析結(jié)果P<0.05時(shí)，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算軟件SPSS。

3 結(jié)果

3.1 SVF細(xì)胞計(jì)數(shù)及ADSCs的鑒定

通過(guò)負(fù)壓吸脂獲取的脂肪組織，經(jīng)消化、過(guò)濾、離心后，得到含ADSCs的SVF細(xì)胞。獲取的SVF活細(xì)胞的平均數(shù)量為(5.31±2.62)×104/ml。提取的SVF單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)化成脂及成骨(圖1～4)，Mark結(jié)果流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，第3代脂肪來(lái)源干細(xì)胞的CD73、CD90為陽(yáng)性，CD45為陰性(圖5)。

3.2 血小板計(jì)數(shù)

全血血小板離心前計(jì)數(shù)為(151.33±59.03)×109/L,PRP血小板離心后計(jì)數(shù)為(615.83±229.78)×109/L，PRP的血小板是全血的4.07倍。

圖1 原代ADSCs加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向分化14 d后胞漿可見(jiàn)反光的脂質(zhì)小滴(×40)圖2 油紅O染色胞漿中見(jiàn)大小不等的紅色脂滴(×40)圖3 原代ADSCs加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向分化14 d后見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)(×20)圖4 茜素紅染色呈陽(yáng)性圖5 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

Fig1 Lipid accumulates within the cell in small vacuoles, which appear as droplets after 14 days of primary ADSCs adipogenic differentiation.Fig2 Adipoenesis stained with Oil Red O.Fig3 Appear calcify after 14 days of primary ADSCs osteogenesis differentiation.Fig4 Alizarin red staining is positive.Fig5 Analysis of flow cytometry.

3.3 PRP對(duì)ADSCs增殖能力的影響

不同時(shí)間段的ADSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)比較可見(jiàn)，隨著PRP濃度逐漸增加，ADSCs的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。因此，PRP對(duì)ADSCs增殖有明顯促進(jìn)作用，數(shù)量統(tǒng)計(jì)學(xué)不同時(shí)間段的ADSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)的組間比較見(jiàn)表1，生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖6。其中，在24 h與48 h的時(shí)間段中，不同濃度的PRP對(duì)ADSCs增殖的細(xì)胞數(shù)量的影響統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異(P>0.05)；72 h與96 h的時(shí)間段中，不同濃度的PRP對(duì)ADSCs增殖的細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，當(dāng)方差分析結(jié)果P<0.05時(shí)，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較(表2)。結(jié)果顯示，在72 h時(shí)段中，15%PRP組細(xì)胞數(shù)量值高于對(duì)照組和5%PRP組(P<0.05)； 96 h時(shí)段中，5%PRP與對(duì)照組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量值的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3.4 ADSCs形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡可見(jiàn)，原代ADSCs形態(tài)呈球形，明亮強(qiáng)反光，懸浮于培養(yǎng)液中，未貼壁。接種24 h后，細(xì)胞貼壁呈短梭形或卵圓形；接種48 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量增加，形態(tài)伸展，呈長(zhǎng)梭形；接種72 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量增加，形態(tài)更加清晰，呈類似成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形外觀；接種96 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)較前有所加快，密度增加，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、多角形或不規(guī)則形。于24,48,72,96 h計(jì)數(shù)后半量換液，懸浮紅細(xì)胞等雜質(zhì)大多被清除，細(xì)胞形態(tài)更清晰(圖7)。

4 討論

ADSCs[1-2]來(lái)源于脂肪組織，通過(guò)分離及培養(yǎng)獲得的一種多向分化潛能的干細(xì)胞，其增殖、分化過(guò)程受多種細(xì)胞因子及激素的調(diào)節(jié)。PRP是來(lái)源于自體血液，通過(guò)離心全血后得到的血小板的濃縮物[3]。激活后的PRP釋放組織生長(zhǎng)所需的大量細(xì)胞因子及蛋白質(zhì)等養(yǎng)分，可為ADSCs提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。自體脂肪移植是治療軟組織缺損和填充的金標(biāo)準(zhǔn)，缺點(diǎn)是脂肪移植有不可預(yù)見(jiàn)性，如重吸收率達(dá)40%～60%，或因壞死形成鈣化和囊腫。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，吸收與脂肪移植后血管新生的速度有關(guān)，主要是由于營(yíng)養(yǎng)缺乏和代謝物沉積導(dǎo)致脂肪細(xì)胞凋亡[4]。Yoshimura等[5-6]針對(duì)臨床脂肪移植出現(xiàn)的脂肪組織吸收率較高、ADSCs細(xì)胞數(shù)量減少的情況，提出了CAL方法，即將新抽取脂肪組織等比例的兩部分，一份用膠原酶消化法提取SVF，另一份抽取的脂肪作為生物支架，將含有ADSCs的SVF加入到抽吸的脂肪中進(jìn)行混合移植，提高ASDCs轉(zhuǎn)化成脂的比例，從而有助于移植脂肪顆粒的存活。近期報(bào)道，PRP復(fù)合脂肪移植能有效地減少脂肪吸收[7-8]。Cervelli等[9]在每毫升的脂肪組織加入0.5 ml的PRP，輪廓在術(shù)后1年仍維持50%～62%。

圖6 不同濃度的PRP和不同時(shí)間段對(duì)ADSCs增殖的影響圖7 PRP濃度分組與時(shí)段分組的ADSCs形態(tài)學(xué)觀察

Fig6 Growth curvature of ADSCs count at at different times and condensations of PRP.Fig7 Histological observation of ADSCs at different times and condensations of PRP.

表1 不同時(shí)間段的ADSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)的組間比較

時(shí)間對(duì)照組5%PRP組10%PRP組15%PRP組F值P值24h3．037±0．7293．117±1．0193．650±1．1724．342±0．9442．930．067848h5．347±1．8664．747±0．7575．859±0．5376．145±0．9193．020．062772h6．212±1．1906．252±0．8627．435±1．8689．220±1．1865．490．009596h7．127±1．4157．920±1．4349．948±1．16412．787±1．37826．98<0．0001

表2 不同時(shí)間段的ADSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)的組間兩兩比較結(jié)果

Tab2 Result of comparison between the groups of ADSCs cell countingin different time

比較組P值72h對(duì)照組vs5%PRP組0．9632對(duì)照組vs10%PRP組0．1720對(duì)照組vs15%PRP組0．00305%PRP組vs10%PRP組0．18565%PRP組vs15%PRP組0．003410%PRP組vs15%PRP組0．053896h對(duì)照組vs5%PRP組0．2665對(duì)照組vs10%PRP組0．0009對(duì)照組vs15%PRP組<0．00015%PRP組vs10%PRP組0．00995%PRP組vs15%PRP組<0．000110%PRP組vs15%PRP組0．0009

目前制作PRP的方法很多，主要有血漿分離置換法、二次離心法、三次離心法等，但缺乏標(biāo)準(zhǔn)性。Kakudo等[10]制備出7.9倍的PRP。筆者采用二次離心法獲得約全血4倍的血小板，首先離心下層沉淀紅細(xì)胞，再次離心分離上層貧血小板血漿，從而純化PRP，激活后應(yīng)用。有學(xué)者報(bào)道，每毫升脂肪中提取SVF細(xì)胞平均含有1×105～1×106個(gè)原代ADSCs[11-12]。本研究中，提取的SVF活細(xì)胞數(shù)量為(5.31±2.62)×104/ml。相比之前的研究，細(xì)胞產(chǎn)量較低，可能與脂肪獲取方式、實(shí)驗(yàn)操作方法和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的靈敏性有關(guān)。筆者通過(guò)給予適當(dāng)?shù)腟VF培養(yǎng)干預(yù)，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化成脂、成骨；原代ADSCs繼續(xù)培養(yǎng)至第3代，用流式細(xì)胞檢測(cè)儀分析細(xì)胞表型，逆推驗(yàn)證SVF中含有ADSCs。采用Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及輔助AO-PI染色法根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征，自動(dòng)、快速測(cè)量細(xì)胞數(shù)量及測(cè)量活細(xì)胞的比率。在以往的研究中，PRP可有效促進(jìn)第3代ADSCs增殖和分化[13]。Van Pham等[14]報(bào)道，PRP可代替胎牛血清，15%PRP增強(qiáng)ADSCs增殖的最優(yōu)濃度。Liu等[15]認(rèn)為,10%～12.5%富含血小板血漿誘導(dǎo)似乎是最佳的濃度。然而幾乎沒(méi)有關(guān)于PRP對(duì)原代ADSCs增殖影響報(bào)道。本研究在原代ADSCs加入PRP后，隨著PRP濃度梯度逐漸增大，ADSCs的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，說(shuō)明PRP能促進(jìn)原代ADSCs的增殖，15%PRP的促進(jìn)作用更明顯。不足之處是，由于含原代ADSCs的SVF也包含多種其他細(xì)胞等雜質(zhì)，通過(guò)兩次離心及淋巴細(xì)胞裂解液作用去除血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞以及大量血液循環(huán)來(lái)源的細(xì)胞，但仍存在異質(zhì)性。樣本量較小，若增加樣本量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果將更為準(zhǔn)確。

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Effectofplatelet-richplasmaontheproliferationofprimaryadipose-derivedstemcells

YANGLing-ling,LIUXiao-yan.
(DepartmentofPlasticSurgery,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo observe the effects of platelet-rich plasma on the number, growth rate and adipogenic differentiation potential of adipose-derived stem cells.MethodsAdipose tissue and venous blood was collected from 6 liposuction female patients. Adipose tissue was separated under sterile condition to collect the stromal vascular fraction cells that contains adipose-derived stem cells. Platelet-rich plasma was isolated from the unit volume of venous blood of the same liposuction patient by the use of centrifugation. Cellometer analyser and AO-PI staining was used to count the amount of stromal vascular fraction living cells. Hematology analyser was used for cell counting on platelet-rich plasma. In vitro experiment, cells were divided as treatment and control groups. The treatment group contained 5%, 10% and 15% platelet-rich plasma while the control group contained 10% fetal bovine serum as the conditions for culture fluid intervention. Cell counting instruments collected the cell count from the control and treatment groups at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h.Results① In this experiment, the stromal vascular fraction osteoblastic and adipogenic conversion test were positive; Detected with Mark test, the expression of CD73 and CD90 at 3rd generation adipose-derived stem cells was positive while the CD45 was negative. This experiment proved adipose-derived stem cells could be collected from stromal vascular fraction. ② Serum centrifugation could obtain an average 4 times platelet of whole blood. ③ Compared with the control group, platelet-rich plasma in treatmental group had higher adipose-derived stem cells number with a increased density (P<0.05) at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h. The platelet-rich plasma with diferent concentration at 48 h and 96 h had obviously promotive effect on the adipose-derived stem cells which had a statistical significance (P<0.05).ConclusionPlatelet-rich plasma can contribute to the growth of primary adipose-derived stem cells in vitro.

Platelet-rich plasma； Adipose-derived stem cells； Stromal vascular fraction

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.03.019

R622.9

A

1673-7040(2014)03-0180-05

2013-12-08)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)(楊玲玲)；沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科(劉曉燕)

楊玲玲(1984-)，女，沈陽(yáng)人，碩士研究生.

劉曉燕，110016，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科，電子信箱：kk-lxy@sohu.com