D 980 nm激光對(duì)大鼠皮膚的組織學(xué)改變及收縮效果影響的實(shí)驗(yàn)研究

倪金影， 張 威， 孫世杰， 馬英君

激光治療

D 980 nm激光對(duì)大鼠皮膚的組織學(xué)改變及收縮效果影響的實(shí)驗(yàn)研究

倪金影， 張 威， 孫世杰， 馬英君

目的通過(guò)觀察D 980 nm激光在連續(xù)模式和脈沖模式下，不同光纖移動(dòng)速度和不同脈沖寬度對(duì)大鼠皮膚的膠原纖維、彈力纖維以及皮膚中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響，評(píng)價(jià)D 980 nm激光對(duì)皮膚的作用。方法選取36只SD大鼠，平均分為6組，其中3組采用連續(xù)模式，3組采用脈沖模式，進(jìn)行皮下照射。激光能量密度為25 J/cm2、功率為5 W。連續(xù)模式組的光纖移動(dòng)速度分別為0.2、0.5、1.0 cm/s；脈沖模式組的脈沖寬度分別為10、20、30 ms(間歇期為10 ms，移動(dòng)速度為0.5 cm/s),術(shù)后3個(gè)月切取各實(shí)驗(yàn)組的大鼠背部皮膚進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果通過(guò)對(duì)大鼠的HE染色、彈力纖維染色、Ⅰ型膠原蛋白的免疫組化染色可知，D 980 nm激光光纖移動(dòng)速度為0.5 cm/s，脈沖寬度為20 ms，皮膚的改善效果較佳。相同作用條件下，脈沖模式優(yōu)于連續(xù)模式。結(jié)論①不同移動(dòng)速度和脈沖寬度均能達(dá)到改善皮膚質(zhì)量的目的。②連續(xù)模式速度為0.5 cm/s時(shí)，脈沖模式脈沖寬度為20 ms時(shí),皮膚的改善效果較佳。③相同條件下，激光脈沖模式優(yōu)于連續(xù)模式，并可見(jiàn)明顯差異。

D 980 nm激光; Ⅰ型膠原蛋白; 光纖速度; 脈沖寬度

容貌的改變是目前最關(guān)注的話題之一。容貌改變的最根本原因是面部皮膚的老化,因此，如何改善皮膚質(zhì)量使其看起來(lái)更加年輕，是人們一直關(guān)注的焦點(diǎn)，近30年出現(xiàn)了很多改善皮膚老化的新技術(shù)[1-2]，但激光作為一種新興的非手術(shù)整形美容治療方法似乎更能夠迎合現(xiàn)今忙碌的人群。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是D 980 nm激光，點(diǎn)陣激光還是強(qiáng)脈沖光均可以達(dá)到改善皮膚質(zhì)量和增加皮膚中膠原蛋白的目的[3-6]。1994年，G Apfelberg等著力研究將光纖插入到直徑為1 mm的套管后引導(dǎo)激光與皮下組織直接接觸，使光纖的作用位置更加準(zhǔn)確。研究還發(fā)現(xiàn)，激光不僅能使脂肪溶解，并有其他有益的作用[7]。自2012年12月至2013年8月，筆者參考此方法，對(duì)D 980 nm激光對(duì)大鼠皮膚的組織學(xué)改變以及收縮效果的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的36只清潔級(jí)SD大鼠。雌雄各18只,體質(zhì)量250～300 g，月齡12～24個(gè)月。室溫20 ℃～25 ℃下，正常分籠飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 D 980激光治療儀(CERAMOPTEC GMBH公司, 德國(guó))，波長(zhǎng)為980 nm。操作模式為連續(xù)/脈沖模式，輸出功率以及脈沖寬度均可調(diào)節(jié)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠平均分為6組，3組采取連續(xù)模式，3組采用脈沖模式，進(jìn)行皮下照射。用10%水合氯醛300 mg/kg進(jìn)行腹腔麻醉，將大鼠背部脊柱兩側(cè)面積為5.0 cm×3.0 cm的區(qū)域分別進(jìn)行脫毛處理，局部碘伏消毒。腫脹麻醉液(0.9%氯化鈉注射液1000 ml+2%利多卡因注射液25 ml+1:1000腎上腺素注射液1 ml+8.4%碳酸氫鈉注射液12.5 ml)在標(biāo)記區(qū)行局部浸潤(rùn)麻醉，調(diào)節(jié)激光器的作用參數(shù)，能量密度為25 J/cm2,功率恒定為5 W，光纖平行作用間距為1.0 cm。當(dāng)光纖皮下作用速度不同時(shí)，激光選擇連續(xù)作用模式，3組速度分別為0.2,0.5和1.0 cm/s；當(dāng)光纖以不同的脈沖寬度作用時(shí)，激光選擇脈沖作用模式，3組脈沖寬度分別為10,20和30 ms(間歇期為10 ms，移動(dòng)速度為0.5 cm/s)。光纖放置在套管內(nèi)，將套管通過(guò)皮膚小插口插入到組織后發(fā)射激光，緩慢而均勻地移動(dòng)光纖套管，相同的參數(shù)下不同移動(dòng)速度和脈沖寬度作用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)組，術(shù)中使用紅外測(cè)溫儀監(jiān)測(cè)體表溫度(需<42 ℃)，術(shù)后背部皮膚涂冷凝膠并密切觀察。

1.4 標(biāo)本制備及保存 術(shù)后3個(gè)月，切取大鼠背部?jī)蓚?cè)盡可能新鮮的皮膚組織，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，PBS沖洗，4%多聚甲醛液中浸泡固定，石蠟包埋，切片。進(jìn)行HE染色、彈力纖維染色和Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染色。

1.5 Ⅰ型膠原蛋白免疫組化圖像半定量分析 參照免疫組化試劑盒的操作方法進(jìn)行免疫組化染色，圖像采用Image-Pro Plus 6.0美國(guó)版進(jìn)行Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)的測(cè)量，每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算出平均每個(gè)視野中Ⅰ型膠原蛋白的陽(yáng)性率，評(píng)分系統(tǒng)=A×B(A為陽(yáng)性率，B為陽(yáng)性強(qiáng)度)，計(jì)算出每個(gè)視野中Ⅰ型膠原蛋白的相對(duì)量。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及彈力纖維染色 真皮明顯增厚，膠原纖維顯著增加、增粗，纖維排列致密，染色較深，脂肪細(xì)胞減少，小血管密集，彈力纖維增多增粗，走行更有序，皮膚表面無(wú)任何損傷。

2.2 免疫組織化學(xué)染色 Ⅰ型膠原蛋白染色位于細(xì)胞外，呈棕黃色為陽(yáng)性。用病理圖文系統(tǒng)對(duì)免疫組化切片結(jié)果進(jìn)行分析，連續(xù)模式3組中，速度為0.5 cm/s組與速度為0.2 cm/s組比較，Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)明顯增多(P<0.01)；速度為0.5 cm/s組與1.0 cm/s組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1,表1。脈沖模式3組中，脈沖寬度為20 ms與脈沖寬度10 ms組和30 ms組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01，P<0.001)，見(jiàn)圖2，表2。當(dāng)連續(xù)模式與脈沖模式在相同條件下作用時(shí)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

3 討論

人隨著年齡的增長(zhǎng)，面部肌膚將會(huì)漸漸地失去原有的青春光澤與活力，取而代之的是干燥、色斑、皺紋、皮膚松弛、毛細(xì)血管擴(kuò)張甚至是皮膚腫瘤[8]。選擇性光熱原理(theory of selective photothermolysis)使得激光與組織的相互作用有了一個(gè)較為完整的理解，推動(dòng)激光在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。激光作為一種新興的非手術(shù)治療方法，主要是作用于皮損部位后，通過(guò)光的選擇性吸收效應(yīng)和生物刺激作用，使真皮膠原纖維被加熱，出現(xiàn)收縮變性，并誘發(fā)真皮內(nèi)的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)產(chǎn)生的膠原蛋白有序的沉積，從而提高皮膚彈性并減少皺紋。最初的剝脫性激光由于治療過(guò)程中不僅汽化了部分的真皮和全部的表皮層，而且術(shù)后出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥。近年來(lái)，通過(guò)技術(shù)不斷的提高，現(xiàn)在取得了很好的進(jìn)展[9]。隨后的非剝脫性激光采用了表面冷卻裝置，但缺乏真正的創(chuàng)面愈合反應(yīng)，而使術(shù)后的效果不夠明顯[10]。為了克服傳統(tǒng)激光治療的不足，出現(xiàn)了兩種激光的有效結(jié)合，即點(diǎn)陣式激光療法，其改善眶周皺紋效果顯著，無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生[11]。Q開(kāi)關(guān)Nd:YAG激光能夠保證表皮角質(zhì)層的完整并取得了一定的成果[12]。

膠原蛋白占人體全身總蛋白的30%以上，女性的膠原蛋白充足皮膚會(huì)細(xì)致光滑且皺紋少[13]。皮膚老化的基本組織學(xué)改變是膠原蛋白的流失，真皮膠原纖維、彈力纖維等有型成分和組織間質(zhì)減少，正是因?yàn)槟z原蛋白和水分的流失，造成皮膚塌陷，支撐皮膚的膠原肽鍵和彈力網(wǎng)斷裂，其螺旋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，肌膚出現(xiàn)干燥、皺紋、松弛無(wú)彈性等衰老現(xiàn)象。所以，要延緩衰老必須要補(bǔ)充膠原蛋白。雖然注射膠原能夠在一定程度上改善皮膚結(jié)構(gòu)[14]，但無(wú)論是口服還是注射真正能被人體吸收的膠原都是微量的，而且維持的時(shí)間較短[15],達(dá)不到更好更快的治療效果。

圖1 3個(gè)月后3組連續(xù)模式中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)(SP ×400) a.移動(dòng)速度0.2 cm/s b.移動(dòng)速度0.5 cm/s c.移動(dòng)速度1.0 cm/s圖2 3個(gè)月后3組脈沖模式中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)(SP ×400) a.脈沖寬度10 ms b.脈沖寬度20 ms c.脈沖寬度30 ms

Fig1 Expression of Ⅰ type collagen at 3 months in the continuous mode groups (SP ×400). a. 0.2 cm/s translational speed. b. 0.5 cm/s translational speed. c. 1.0 cm/s translational speed.Fig2 Expression of Ⅰ type collagen at 3 months in the pulse mode groups (SP ×400).a. 10 ms pulse width. b. 20 ms pulse width. c. 30 ms pulse width.

表1 3組連續(xù)模式中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)

移動(dòng)速度(cm/s)Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性值0.20.58±0.170.51.04±0.21a1.00.98±0.31b

注：a表示0.2 cm/s與0.5 cm/s相比,P<0.01;b表示0.5 cm/s 與1.0 cm/s相比，P>0.05

表2 3組脈沖模式中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)

脈沖寬度/msⅠ型膠原蛋白陽(yáng)性值100.61±0.31201.41±0.26a300.58±0.21b

注：a表示10 ms與20 ms相比,P<0.01;b表示20 ms與30 ms相比,P<0.001

表3 連續(xù)模式組和脈沖模式組中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)

操作模式Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性值 連續(xù)模式(0.5cm/s)1.04±0.21 脈沖模式/20ms1.41±0.26a

注：a表示連續(xù)模式與脈沖模式相比,P<0.05

本研究所使用的D 980 nm激光不同于傳統(tǒng)的激光療法，其特有的波長(zhǎng)能夠不傷害表皮層，可直接插入作用于皮膚真皮層，通過(guò)光熱效應(yīng)加熱靶組織，使激光的作用位置更加準(zhǔn)確。既然加熱皮膚即可增加皮膚有型成分的含量，那么我們只要選擇不破壞表皮，而直接加熱真皮的激光就可以達(dá)到“嫩膚”的目的。大量的實(shí)驗(yàn)證明，真皮組織被加熱后，可直接或通過(guò)一系列相關(guān)的細(xì)胞因子使膠原細(xì)胞產(chǎn)生新的膠原，并通過(guò)直接汽化或改變代謝的方法去除皮膚表面的色素性損傷。激光治療已能在術(shù)后達(dá)到很好的效果，最重要的是激光可以刺激結(jié)締組織中的膠原蛋白與彈力纖維的數(shù)量與走行，使組織重新粘連，達(dá)到皮膚收縮的效果。激光輔助下的皮膚溶脂與緊縮在臨床上的效果明顯，其在治療上更側(cè)重于激光治療后膠原蛋白與彈性纖維的改變對(duì)皮膚緊縮程度的影響，而不是大量的吸出脂肪組織，同時(shí)能夠刺激膠原纖維和彈力纖維的增多，且術(shù)后的并發(fā)癥較少。本研究證實(shí)，術(shù)后3個(gè)月皮膚達(dá)到了結(jié)構(gòu)重塑的作用，膠原纖維、彈力纖維排列的更加緊密。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)組織學(xué)和Ⅰ型膠原蛋白的免疫組織化觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激光選擇連續(xù)作用模式速度為0.5 cm/s時(shí),效果較好；當(dāng)激光選擇脈沖作用模式，脈沖寬度設(shè)定為20 ms時(shí)，可達(dá)到較佳的改善皮膚效果?？傊す庠诿娌康钠つw年輕化方面有著廣闊的應(yīng)用前景，新型激光器的應(yīng)用使治療效果和安全性得到了一定程度的兼顧，其他激光治療在國(guó)內(nèi)開(kāi)展的時(shí)間還不長(zhǎng)，還存在不少有待進(jìn)一步探討的問(wèn)題，如適應(yīng)證的選擇，療程的設(shè)置以及療效的客觀判定標(biāo)準(zhǔn)等，尤其是更適合中國(guó)人膚質(zhì)的治療參數(shù)。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)觀察到，D 980 nm激光具有促進(jìn)大鼠皮膚膠原纖維、彈力纖維和Ⅰ型膠原蛋白含量增加的功效，為D 980 nm在臨床上進(jìn)行皮膚質(zhì)量改善方面的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供了更好的理論依據(jù)，同時(shí)觀察到不同的光纖皮下移動(dòng)速度和不同的脈沖寬度中，0.5 cm/s和20 ms具有更好的刺激真皮層中Ⅰ型膠原蛋白合成的作用，當(dāng)連續(xù)模式與脈沖模式在相同條件下作用時(shí)，后者效果明顯優(yōu)于前者。以上可以作為今后臨床應(yīng)用中的參考參數(shù)。

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EffectsofD980nmlaseronhistologicalchangesandcontractionofratskin

NIJin-ying,ZHANGWei,SUNShi-jie,etal.

(DepartmentofMaxillofacialSurgery,StomatologyCollegeofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo evaluate the effects of D 980 nm with different movement speed and pulse width on the collagen fibers, elastic fibers and expression of Ⅰ type collagen under continuous and pusle mode.MethodsThirty-six SD rats were divided randomly into 6 groups, three were treated with subcutaneous irradiation under continuous mode, the other three were adopted with that under pulse mode. The laser energy density was 25 J/cm2and power was 5 W. The translational speed of optical fiber in the continuous mode groups were 0.2, 0.5 and 1.0 cm/s, pulse width were 10, 20 and 30 ms in the pulse mode groups with 10 ms intermission and 0.5 cm/s translational speed. The samples harvested from the dorsal skin of each group at 3 months were detected.ResultsD 980 nm laser at 0.5 cm/s translational speed and 20 ms pulse width could obtain the best effect on refirming. In the same conditions, the pulse mode surpassed the continuous mode.Conclusion①Different speed and pulse width can achieve the purpose of improving the quality of the skin. ②Under the same parameters, D 980 nm laser at 0.5 cm/s translational speed and 20 mspulse width could obtain the best effect on refirming. ③In the same conditions, the pulse mode surpassed the continuous mode with obvious difference.

D 980 nm Laser; Ⅰ type collagen; Optical fiber speed; Pulse width

154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院 頜面外科

倪金影(1988-)，女，黑龍江人，碩士研究生.

張 威，154002，佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院 頜面外科，電子信箱：kinwai01@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.07.006

R454.2

A

1673-7040(2014)07-0399-04

2014-05-10)