劍麻殘渣皂苷元高產(chǎn)率菌株的篩選及特性研究

孫昊+劉建國+朱桂梅+李海云+郝再彬

摘要通過微生物發(fā)酵法將劍麻皂苷轉(zhuǎn)化成皂苷元.采集桂林喀斯特地貌土壤樣品，從能夠降解皂苷糖基的多個菌株中篩選出JM7，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適條件：溫度30 ℃、pH為6、發(fā)酵時間5 d、底物質(zhì)量濃度6 g/L，并且對產(chǎn)物皂苷元進行了HPLC檢測和單晶衍射測定.

關(guān)鍵詞劍麻皂苷；皂苷元；菌株篩選；發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號Q93；S567文獻標(biāo)識碼A文章編號10002537（2014）04002904

工業(yè)生產(chǎn)劍麻纖維時剩余的抽絲汁液和殘渣中含有豐富的劍麻皂苷資源，轉(zhuǎn)化提取出的皂苷元可以改善小鼠糖耐量[1]；劍麻皂苷元能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖水平，對腎上腺素高血糖大鼠也有降血糖作用[2].劍麻皂苷元（Tigogenin，圖1）是螺甾烷醇的衍生物，是合成甾體激素類藥物的醫(yī)藥中間體和重要原料，廣泛應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)激素、性激素及蛋白同化激素，三大類激素可以制造200多種藥物[34].用甲醇提取劍麻葉汁中的化合物，分離得到5個甾體皂苷 A、B、C、D、E[5]，均可用于皂苷元的轉(zhuǎn)化.藥理研究表明，這種皂苷元成分具有較明顯的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性[6].

目前工業(yè)生產(chǎn)劍麻皂苷元采用硫酸加熱回流提取法[7]，通過多次醇提酸解皂苷得到皂苷元產(chǎn)品.大量醇和酸對環(huán)境造成很大危害，同時也提高了生產(chǎn)成本.因此，新型的無污染低能耗的劍麻皂苷元生產(chǎn)方法亟待研究與開發(fā)，本實驗篩選出產(chǎn)生劍麻皂苷元的高活性發(fā)酵微生物，為工業(yè)化生產(chǎn)開辟了一條新途徑.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與培養(yǎng)基 土壤樣品：實驗室采集桂林喀斯特地貌的土壤樣品200份.篩選培養(yǎng)基：絞股藍(lán)皂苷2 g；瓊脂2 g；硫酸亞鐵0.001 g；硫酸鎂0.05 g；氯化鈉0.05 g；磷酸氫二鉀005 g；硝酸鉀0.1 g；水100 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，121 ℃滅菌20 min，搖勻后倒平板.

酸鉀、氫氧化鈉、鹽酸、香草醛、乙酸、高氯酸，以上試劑均為分析純.

儀器：TU1800S 紫外分光光度計（美國VARIAN公司）；BS110S （塞多利斯）電子天平（北京塞多利斯有限公司）；LRH150Z振蕩培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；DKS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；島津LC20AB高效液相色譜儀，ELSD檢測器；氮氣（99.9%，廣西桂林海灣恒日化工氣體有限公司）；KQ400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SIGMA 3K30離心機（德國希格瑪離心機有限公司）.

1.2實驗方法

1.2.1制備皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 比色法[8]：稱量標(biāo)準(zhǔn)品劍麻皂苷5.00 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL.分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mL置于25 mL具塞試管中，以空白管作對照，在70 ℃下烘干后冷卻至室溫.各管中依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻后置于70 ℃烘箱中加熱15 min，取出后迅速流水冷卻至室溫，再分別加入5 mL冰醋酸，搖勻，于450 nm處測定吸光度.以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線.

色譜法[912]：Shimpack VPODS C18柱 （250 mm×4.6 mm，5μm），ELSDLTⅡ檢測器，漂移管溫度40 ℃，載氣壓力350 kPa，流動相為甲醇和水（體積比V（甲醇）∶〖KG-2mm〗V（水）=9∶〖KG-2mm〗1），流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，時間35 min.稱量劍麻皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇為溶劑制備1 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液定容于容量瓶.

1.2.2菌種篩選 初篩：將標(biāo)記好的土壤樣品置于小花盆中，加入劍麻殘渣以及PDA營養(yǎng)液，陰涼避光處放置一個月，期間周期性補充水分和營養(yǎng)液.

復(fù)篩：取初篩小花盆中的土壤樣品，在篩選培養(yǎng)基上劃線，由于皂苷有很強的抑菌性，一般的微生物種群難以在該培養(yǎng)基上生長，利用這種選擇性即可初步得到可用的菌種群，再對其進行液體發(fā)酵培養(yǎng)測定產(chǎn)物含量，獲得高活性菌種.

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)方法 制備發(fā)酵液：取干燥劍麻殘渣打碎，加入自來水調(diào)至質(zhì)量濃度為75 g/L，加熱至沸騰2 h，4 500 r/min離心取上清液作為發(fā)酵液.發(fā)酵培養(yǎng)：按1%接種量將菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（300 mL瓶裝液150 mL），于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30 ℃ 下250 r/min震蕩培養(yǎng).

1.2.4發(fā)酵產(chǎn)物皂苷元檢測 發(fā)酵結(jié)束后瓶中的發(fā)酵液4 500 r/min離心，沉淀即含有皂苷元代謝物，烘干粉碎后用三氯甲烷（20 mL/g沉淀物）超聲震蕩提取60 min，提取液4 500 r/min離心取上清液旋蒸濃縮后烘干得粉末，蒸餾水洗3次，烘干作為待測樣品，進行HPLC檢測.另取一部分待測樣品溶于無水乙醇，常溫下進行結(jié)晶，得到的樣品晶體進行單晶衍射測定樣品結(jié)構(gòu).

1.2.5發(fā)酵條件優(yōu)化

2結(jié)果與討論

2.1檢測方法

按照1.2.1中所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），劍麻皂苷質(zhì)量為0.1～0.7 mg，曲線方程為y=1459 8x+0.030 7，R2為0.992 2，相關(guān)性較好，本實驗中對發(fā)酵液中皂苷質(zhì)量的測定均采用此法.

2.2菌種篩選

通過對200份土壤樣品的初篩和復(fù)篩，共得到有降解皂苷效果的菌株13株（表1），其中JM4、JM5、JM7和JM12這4種菌株效果比較明顯，最終選擇降解率最高的菌種JM7號作為目的菌種進行后續(xù)實驗.

2.3發(fā)酵產(chǎn)物測定

2.4發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1最適溫度 溫度對于劍麻皂苷降解率的影響如圖5（A），從圖中可以看出在30 ℃條件下發(fā)酵后劍麻皂苷降解率最高，達(dá)到52.6%，隨著溫度改變降解率降低，故最適溫度為30 ℃.

2.4.2最適pH 如圖5（B）所示，發(fā)酵液pH為6時發(fā)酵后劍麻皂苷的降解率最高，為53%，pH值改變后降解率顯著下降，故確定發(fā)酵液最適pH為6.

2.4.3最適發(fā)酵時間 不同發(fā)酵時間后JM7對劍麻皂苷的降解率如圖5（C），由圖可知，降解率隨發(fā)酵時間的增加而逐步增大，發(fā)酵5 d時降解率基本穩(wěn)定在53%，此后繼續(xù)發(fā)酵降解率基本無變化，增加發(fā)酵時間則無意義，故最優(yōu)發(fā)酵時間為5 d.

2.4.4最適底物濃度 如圖5（D）所示，由于劍麻皂苷本身具有較強的抑菌性，故隨著皂苷質(zhì)量濃度的增大降解率明顯下降，皂苷為2 g/L時降解率最高，但考慮到降解皂苷的總量需要找到底物質(zhì)量濃度盡可能大的一組，通過計算得出底物質(zhì)3結(jié)論

通過多次篩選得到了一種能夠降解劍麻皂苷生產(chǎn)劍麻皂苷元的高活性微生物，該菌種在偏酸性、低濃度發(fā)酵液中有著良好的降解能力，發(fā)酵5 d后降解率達(dá)到53%，使用HPLC方法和單晶衍射方法檢測其發(fā)酵產(chǎn)物，可以確定其發(fā)酵產(chǎn)物為劍麻皂苷元.對其進行了不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵時間和底物質(zhì)量濃度下發(fā)酵的初步研究，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，pH 6，發(fā)酵時間5 d，底物質(zhì)量濃度6 g/L，該微生物的發(fā)現(xiàn)為工業(yè)化生產(chǎn)劍麻皂苷元提供了新的方法.

參考文獻：

[1]〖ZK（#〗李燕婧，周桂芬，韋善新，等.劍麻皂苷藥理作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥， 2006，17（10）：19581959.

[2]賴克道，李燕婧，李茂.劍麻皂苷降血糖作用的研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報， 2010，26（1）：5658.

[3]吳立軍，婁紅祥，周晶.天然藥物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 2011.

[4]計志忠.化學(xué)制藥工藝學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997.

[5]DING Y， TIAN R H， YANG C R， et al. Two new steroidal saponins from dried femented residues of leafjuices of A gave sisalana form a dong No 1[J].Chem Pham Bull， 1993，41：557560.

[6]宣偉東，陳海生，譚興起，等.HPLCELSD法測定刺蒺藜中甾體皂苷TTS12含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2005，26（2）：222223.

[7]周寅，張夢宇，白楊，等.劍麻皂苷的分離純化工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，39（8）：45404542.

[8]馬超，丁怡，王偉，等.劍麻總皂苷制備工藝研究[J].中國中藥雜志， 2005，30（5）：391393.

2.4發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1最適溫度 溫度對于劍麻皂苷降解率的影響如圖5（A），從圖中可以看出在30 ℃條件下發(fā)酵后劍麻皂苷降解率最高，達(dá)到52.6%，隨著溫度改變降解率降低，故最適溫度為30 ℃.

2.4.2最適pH 如圖5（B）所示，發(fā)酵液pH為6時發(fā)酵后劍麻皂苷的降解率最高，為53%，pH值改變后降解率顯著下降，故確定發(fā)酵液最適pH為6.

2.4.3最適發(fā)酵時間 不同發(fā)酵時間后JM7對劍麻皂苷的降解率如圖5（C），由圖可知，降解率隨發(fā)酵時間的增加而逐步增大，發(fā)酵5 d時降解率基本穩(wěn)定在53%，此后繼續(xù)發(fā)酵降解率基本無變化，增加發(fā)酵時間則無意義，故最優(yōu)發(fā)酵時間為5 d.

2.4.4最適底物濃度 如圖5（D）所示，由于劍麻皂苷本身具有較強的抑菌性，故隨著皂苷質(zhì)量濃度的增大降解率明顯下降，皂苷為2 g/L時降解率最高，但考慮到降解皂苷的總量需要找到底物質(zhì)量濃度盡可能大的一組，通過計算得出底物質(zhì)3結(jié)論

通過多次篩選得到了一種能夠降解劍麻皂苷生產(chǎn)劍麻皂苷元的高活性微生物，該菌種在偏酸性、低濃度發(fā)酵液中有著良好的降解能力，發(fā)酵5 d后降解率達(dá)到53%，使用HPLC方法和單晶衍射方法檢測其發(fā)酵產(chǎn)物，可以確定其發(fā)酵產(chǎn)物為劍麻皂苷元.對其進行了不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵時間和底物質(zhì)量濃度下發(fā)酵的初步研究，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，pH 6，發(fā)酵時間5 d，底物質(zhì)量濃度6 g/L，該微生物的發(fā)現(xiàn)為工業(yè)化生產(chǎn)劍麻皂苷元提供了新的方法.

參考文獻：

[1]〖ZK（#〗李燕婧，周桂芬，韋善新，等.劍麻皂苷藥理作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥， 2006，17（10）：19581959.

[2]賴克道，李燕婧，李茂.劍麻皂苷降血糖作用的研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報， 2010，26（1）：5658.

[3]吳立軍，婁紅祥，周晶.天然藥物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 2011.

[4]計志忠.化學(xué)制藥工藝學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997.

[5]DING Y， TIAN R H， YANG C R， et al. Two new steroidal saponins from dried femented residues of leafjuices of A gave sisalana form a dong No 1[J].Chem Pham Bull， 1993，41：557560.

[6]宣偉東，陳海生，譚興起，等.HPLCELSD法測定刺蒺藜中甾體皂苷TTS12含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2005，26（2）：222223.

[7]周寅，張夢宇，白楊，等.劍麻皂苷的分離純化工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，39（8）：45404542.

[8]馬超，丁怡，王偉，等.劍麻總皂苷制備工藝研究[J].中國中藥雜志， 2005，30（5）：391393.

2.4發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1最適溫度 溫度對于劍麻皂苷降解率的影響如圖5（A），從圖中可以看出在30 ℃條件下發(fā)酵后劍麻皂苷降解率最高，達(dá)到52.6%，隨著溫度改變降解率降低，故最適溫度為30 ℃.

2.4.2最適pH 如圖5（B）所示，發(fā)酵液pH為6時發(fā)酵后劍麻皂苷的降解率最高，為53%，pH值改變后降解率顯著下降，故確定發(fā)酵液最適pH為6.

2.4.3最適發(fā)酵時間 不同發(fā)酵時間后JM7對劍麻皂苷的降解率如圖5（C），由圖可知，降解率隨發(fā)酵時間的增加而逐步增大，發(fā)酵5 d時降解率基本穩(wěn)定在53%，此后繼續(xù)發(fā)酵降解率基本無變化，增加發(fā)酵時間則無意義，故最優(yōu)發(fā)酵時間為5 d.

2.4.4最適底物濃度 如圖5（D）所示，由于劍麻皂苷本身具有較強的抑菌性，故隨著皂苷質(zhì)量濃度的增大降解率明顯下降，皂苷為2 g/L時降解率最高，但考慮到降解皂苷的總量需要找到底物質(zhì)量濃度盡可能大的一組，通過計算得出底物質(zhì)3結(jié)論

通過多次篩選得到了一種能夠降解劍麻皂苷生產(chǎn)劍麻皂苷元的高活性微生物，該菌種在偏酸性、低濃度發(fā)酵液中有著良好的降解能力，發(fā)酵5 d后降解率達(dá)到53%，使用HPLC方法和單晶衍射方法檢測其發(fā)酵產(chǎn)物，可以確定其發(fā)酵產(chǎn)物為劍麻皂苷元.對其進行了不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵時間和底物質(zhì)量濃度下發(fā)酵的初步研究，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，pH 6，發(fā)酵時間5 d，底物質(zhì)量濃度6 g/L，該微生物的發(fā)現(xiàn)為工業(yè)化生產(chǎn)劍麻皂苷元提供了新的方法.

參考文獻：

[1]〖ZK（#〗李燕婧，周桂芬，韋善新，等.劍麻皂苷藥理作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥， 2006，17（10）：19581959.

[2]賴克道，李燕婧，李茂.劍麻皂苷降血糖作用的研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報， 2010，26（1）：5658.

[3]吳立軍，婁紅祥，周晶.天然藥物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 2011.

[4]計志忠.化學(xué)制藥工藝學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997.

[5]DING Y， TIAN R H， YANG C R， et al. Two new steroidal saponins from dried femented residues of leafjuices of A gave sisalana form a dong No 1[J].Chem Pham Bull， 1993，41：557560.

[6]宣偉東，陳海生，譚興起，等.HPLCELSD法測定刺蒺藜中甾體皂苷TTS12含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2005，26（2）：222223.

[7]周寅，張夢宇，白楊，等.劍麻皂苷的分離純化工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，39（8）：45404542.

[8]馬超，丁怡，王偉，等.劍麻總皂苷制備工藝研究[J].中國中藥雜志， 2005，30（5）：391393.