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    非梗阻性無精子癥患者睪丸生精細(xì)胞體外培養(yǎng)后受精能力的研究

    2014-10-21 20:08:05檀大羨莫毅陳自洪等
    中國性科學(xué) 2014年2期

    檀大羨 莫毅 陳自洪等

    【摘要】目的:探討非梗阻性無精子癥患者睪丸生精細(xì)胞體外培養(yǎng)后的受精能力。方法:選取8例非梗阻性無精子癥患者的睪丸組織制備成生精細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)后得到長形精子細(xì)胞顯微注射到卵細(xì)胞內(nèi),觀察其受精情況。結(jié)果:8例患者睪丸生精細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后均有不同程度的分化、成熟。將培養(yǎng)后接近成熟的精子細(xì)胞通過顯微注射到卵細(xì)胞內(nèi),卵細(xì)胞受精率為4.52%,熒光原位雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示卵細(xì)胞有受精。結(jié)論:非梗阻性無精子癥患者睪丸生精細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后有潛在的受精能力。

    【關(guān)鍵詞】無精子癥;生精細(xì)胞;體外培養(yǎng);顯微受精;熒光原位雜交

    自20世紀(jì)90年代以來,睪丸生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)已有一定程度的進(jìn)展,可將人類睪丸生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)到接近成熟[1],但未見對(duì)培養(yǎng)后其受精能力的報(bào)道。現(xiàn)對(duì)人類非梗阻性無精子癥患者的睪丸生精細(xì)胞在體外培養(yǎng),將培養(yǎng)后接近成熟的精子細(xì)胞通過顯微注射到卵細(xì)胞內(nèi)后觀其受精情況,報(bào)道如下。

    1材料與方法

    1.1對(duì)象

    選取經(jīng)睪丸病理活檢確診為非梗阻性無精子癥患者8例,年齡23~36歲;第二性征(胡須、喉結(jié)、陰毛生長)發(fā)育良好2例,發(fā)育不良6例;睪丸5~10mL,平均(7.56±2.25)mL,血清卵泡刺激素(FSH) 13.25~32.49IU/L,平均(21.35±9.62) IU/L;血清黃體生成素(LH) 7.56~16.58IU/L,平均(12.52±3.47) IU/L。

    1.2主要儀器、試劑

    顯微注射操作儀(Olympus)、熒光原位雜交儀(Thermabrite)和細(xì)胞培養(yǎng)基(Sigma)、胰蛋白酶溶液(上海)、EDTA溶液(武漢)、膠原酶溶液(上海)、CO2培養(yǎng)箱。

    1.3方法

    1.3.1睪丸組織的獲取8例非梗阻性無精子癥患者的睪丸組織通過睪丸活檢獲得,組織置于HTF中送回實(shí)驗(yàn)室。按本室建立的方法[2]獲取睪丸生精細(xì)胞和支持細(xì)胞。

    1.3.2生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法睪丸組織分離后按本實(shí)驗(yàn)室建立的方法培養(yǎng)[3]。

    1.3.3卵胞漿內(nèi)精子細(xì)胞顯微注射在顯微鏡下選擇培養(yǎng)了5d后獲得的長形精子細(xì)胞,采用顯微注射技術(shù)將長形精子細(xì)胞注入卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,置于HTF1026培養(yǎng)液的微滴中在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3.4熒光原位雜交試驗(yàn)使用雙色DNA熒光標(biāo)記探針(CEP X、Y)分別對(duì)未受精卵和ICSI后的受精卵進(jìn)行原位雜交分析,具體操作參照文獻(xiàn)[4]。樣品逐枚滴于多聚賴氨酸防脫玻片上,并對(duì)相應(yīng)位置進(jìn)行標(biāo)記,便于探針雜交及熒光分析。玻片經(jīng)洗滌、低滲、固定處理后,使用含2.5 mmol/L DTT的 1×PBS處理20 min使染色體去凝集,2×SSC洗滌和乙醇脫水風(fēng)干,60℃烤箱中烤片2.5h,染色體和探針變性雜交、洗脫、DAPI復(fù)染。使用熒光顯微鏡的WU、WIG和WIB濾光片分別觀察樣品內(nèi)的熒光信號(hào),并進(jìn)行攝像及記錄分析。熒光信號(hào)判定:綠色熒光信號(hào)為X染色體,紅色熒光信號(hào)為Y染色體。

    2結(jié)果

    2.1生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的結(jié)果

    本研究中,睪丸組織經(jīng)酶消化后在顯微鏡下可觀察到未成熟的生精細(xì)胞,包括有精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞以及支持細(xì)胞。這些未成熟的生精細(xì)胞培養(yǎng)后第2至3d,在倒置顯微鏡下可見有圓形精子細(xì)胞出現(xiàn),第5d后,見有長形精子細(xì)胞出現(xiàn),經(jīng)計(jì)數(shù)初級(jí)精母細(xì)胞分化為精子細(xì)胞的分化率約3.35%。

    2.2卵胞漿內(nèi)精子細(xì)胞顯微注射后的結(jié)果

    選擇培養(yǎng)獲得的長形精子細(xì)胞,分別注射到47個(gè)MⅡ期的卵母細(xì)胞胞漿中,其中觀察到有2個(gè)卵母細(xì)胞出現(xiàn)2個(gè)雌雄原核和2個(gè)極體,受精率為4.26%。

    2.3熒光原位雜交分析結(jié)果

    經(jīng)熒光原位雜交分析,觀察未受精卵5個(gè),在熒光激發(fā)后只觀察到1個(gè)綠色熒光標(biāo)記,說明只存在X染色體而無Y染色體;觀察出現(xiàn)受精的兩個(gè)受精卵,其中1枚顯微注射后受精卵內(nèi)含有2個(gè)綠色熒光標(biāo)記,另一枚顯微注射后受精卵內(nèi)含有1個(gè)綠色熒光和1個(gè)紅色熒光標(biāo)記,熒光原位雜交分析結(jié)果表明兩個(gè)卵細(xì)胞已經(jīng)受精。

    3討論

    人類生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)后能獲得進(jìn)一步的分化和成熟。Hasegawa等已能將初級(jí)精母細(xì)胞培養(yǎng)到精子細(xì)胞階段,精子細(xì)胞能進(jìn)一步變形成長形精子細(xì)胞[5-7],有些精子細(xì)胞出現(xiàn)鞭毛,直至獲得成熟的精子[8]。本研究中,生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)后可從初級(jí)精母細(xì)胞分化到精子細(xì)胞分階段,分化率約3.35%,而且精子細(xì)胞可變形為長形精子細(xì)胞,這一研究結(jié)果與國外研究相比較,其分化率仍較低,雖然比本室以往的結(jié)果[3]有所提高,但仍有待進(jìn)一步改善培養(yǎng)技術(shù),以獲得更好的結(jié)果。

    隨著生精細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)和生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,人們已能進(jìn)行卵胞質(zhì)內(nèi)圓形精子細(xì)胞注射術(shù)(round spermatid injection, ROSI)和卵胞質(zhì)內(nèi)長形精子細(xì)胞注射術(shù)(elongate spermatid injection, ELSI)[9]。Tesarik等[10]于1996年報(bào)道了ROSI第一例嬰兒出生,隨后,他們將培養(yǎng)后變形的長形精子細(xì)胞通過ELSI技術(shù)使患者的配偶獲妊娠成功,產(chǎn)下發(fā)育正常的雙胞胎嬰兒。Sousa等[11]將接近成熟的長形精子細(xì)胞ELSI,卵母細(xì)胞的受精率約為31%~38%,且有囊胚形成。本研究將培養(yǎng)后獲得的47個(gè)長形精子細(xì)胞注射入卵母細(xì)胞內(nèi),有2個(gè)受精,而且已經(jīng)FISH檢測證實(shí),其受精率為4.26%。但是,我們依然看到,ROSI與ELSI技術(shù)的效果與采用成熟成活的精子的ICSI相比仍較低,本研究的受精率僅為4.26%,表明這一技術(shù)有待進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn)

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    [2]檀大羨,王植柔,李蓮軍,等.大鼠生精細(xì)胞分離方法的研究.中國計(jì)劃生育學(xué)雜志,2005,13(4):234-236.

    [3]檀大羨,王植柔,劉鋒,等.人類睪丸生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的初步研究.廣西醫(yī)學(xué), 2005, 27(8): 1136-1139.

    [4]檀大羨,謝丹尼,莫毅,等.男性不育患者精子XY染色體的熒光原位雜交分析.中國熱帶醫(yī)學(xué),2012 ,12 (7): 878-879.

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    [10]Tesarik J, Rolet F, Brami C, et al. Spermatid injection into human oocytes. II. Clinical application in the treatment of infertility due to nonobstructive azoospermia. Hum Reprod,1996,11(4):780-783.

    [11]Sousa M,Cremades N,Alves C,et al.Developmental potential of Human spermatogenic cells cocultured with Sertoli cells.Hum Reprod,2002,17(1):161-172.

    (收稿日期:2013-10-15)

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