虎杖中白藜蘆醇的提取與純化

王 瑩，李夢(mèng)耀，馬 嵐，王莉莉

(1.長(zhǎng)安大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710054;2.長(zhǎng)安大學(xué)旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710054)

白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物［1］，是天然的抗氧化劑［2-4］，具有降低血液粘稠度、抑制血小板凝結(jié)和血管舒張、保持血液暢通等功能［5］，可預(yù)防癌癥［6-8］的發(fā)生及發(fā)展，還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用［9］等等。白藜蘆醇的制備方法包括天然植物提取法、化學(xué)合成法、生物工程技術(shù)法等。

本文研究了虎杖中白藜蘆醇的提取工藝，用LS-303大孔吸附樹脂分離純化虎杖提取液中白藜蘆醇。液相色譜分析表明，LS-303大孔吸附樹脂分離純化虎杖白藜蘆醇提取液所得白藜蘆醇溶液純度高，雜質(zhì)少。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

LS-303大孔吸附樹脂，工業(yè)品;虎杖(資生堂藥店);白藜蘆醇(96%);無(wú)水乙醇、95%乙醇、硫酸、濃鹽酸、重鉻酸鉀、氫氧化鈉、氯仿、乙酸乙酯均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

WFZ-26紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);SHZ-82型恒溫振蕩器;320型pH計(jì)。

1.2 樹脂預(yù)處理

用95%乙醇浸泡24 h，蒸餾水沖洗，蒸餾水浸泡保存，使用前抽濾。

1.3 藜蘆醇儲(chǔ)備液(1 000μg/mL)的配制

準(zhǔn)確稱量白藜蘆醇0.104 2 g，用無(wú)水乙醇溶解，定容至100 mL的容量瓶，制成1 000μg/mL白藜蘆醇儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)中其它濃度的白藜蘆醇溶液均由儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋獲得。

1.4 白藜蘆醇的測(cè)定——紫外分光光度法

溶液中白藜蘆醇濃度的測(cè)定采用紫外分光光度法，測(cè)定波長(zhǎng)306 nm。吸光度與白藜蘆醇濃度的關(guān)系:A=0.116 9c+0.006 4，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.999 5。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 白藜蘆醇的提取 把虎杖烘干、粉碎、過(guò)40目篩。取虎杖粉末2.00 g，加入70%(V/V)的乙醇100 mL，60℃下水浴恒溫浸提3 h。抽濾，得提取液。紫外分光光度法測(cè)提取液中白藜蘆醇的濃度。計(jì)算一次提取率。連續(xù)提取4次的總量作為虎杖中白藜蘆醇的含量。

1.5.2 虎杖白藜蘆醇提取液的純化 3 g濕樹脂裝于玻璃柱中(柱內(nèi)徑10 mm，樹脂高約85 mm)。將50 mL虎杖白藜蘆醇提取液以一定的流速通過(guò)吸附柱，并且水洗;加入一定體積的解吸劑解吸，對(duì)提取原液和經(jīng)過(guò)樹脂吸附-解吸后的純化液分別作高效液相色譜分析。

1.6 大孔樹脂吸附白藜蘆醇

1.6.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 在250 mL錐形瓶中放入1.00 g濕樹脂，加入50 mL白藜蘆醇溶液，在恒定溫度下振蕩3 h，達(dá)到吸附平衡為止。準(zhǔn)確測(cè)量剩余白藜蘆醇溶液的濃度，計(jì)算吸附量。

式中 q——吸附量，μg/g;

c0——吸附前白藜蘆醇溶液的濃度，μg/mL;

c——吸附平衡后溶液中剩余白藜蘆醇溶液的濃度，μg/mL;

w——濕樹脂的質(zhì)量，g;

V——溶液的體積，mL。

1.6.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 把經(jīng)過(guò)上述吸附處理的含有白藜蘆醇溶液的樹脂與溶液進(jìn)行分離，用蒸餾水除去樹脂表面殘余的白藜蘆醇，抽濾，除去樹脂中剩余的水分。把樹脂放入250 mL的錐形瓶中，加入50 mL解吸劑，振蕩3 h，以達(dá)到解吸平衡，最后測(cè)定白藜蘆醇溶液的濃度，計(jì)算靜態(tài)解吸率Rd。

式中 Rd——解吸率，%;

c——解吸劑中白藜蘆醇平衡濃度，μg/mL;

V——解吸劑體積，mL;

w——樹脂上負(fù)載白藜蘆醇的質(zhì)量，μg。

1.6.3 動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取3 g濕樹脂，濕法裝柱(內(nèi)徑為10 mm，樹脂裝大約85 mm高)。在柱子下端鋪襯少許玻璃毛，用玻璃棒把樹脂壓實(shí)，在樹脂上面同樣鋪襯玻璃毛。按照一定的流速使50 mL的白藜蘆醇溶液通過(guò)吸附柱，接取50 mL的白藜蘆醇流出液測(cè)定它的濃度，計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附率。用水洗吸附了白藜蘆醇的柱子，接著用解吸劑解吸，測(cè)解吸后白藜蘆醇的濃度。

式中 c0——吸附前白藜蘆醇的濃度，μg/mL;

c——吸附后白藜蘆醇的濃度，μg/mL;

Ra——?jiǎng)討B(tài)吸附率，% 。

2 結(jié)果與討論

2.1 虎杖中白藜蘆醇的提取

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、溫度按3因素3水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，提取2 h，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 虎杖中白藜蘆醇提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Orthogonal experimental result of resveratrol extraction from Polygonum cuspidatum

由表1可知，最佳工藝條件為 A3B3C1，溫度70℃，乙醇體積分率70%，固液比2 g/100 mL，提取2 h。

2.2 大孔樹脂吸附白藜蘆醇

2.2.1 吸附動(dòng)力學(xué) LS-303大孔吸附樹脂吸附白藜蘆醇動(dòng)力學(xué)見(jiàn)圖1。

圖1 吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Curve of adsorption kinetics

由圖1可知，吸附開始時(shí)，吸附量隨時(shí)間延長(zhǎng)迅速增大，40 min后變慢，90 min后，吸附接近平衡。90 min內(nèi)，LS-303樹脂對(duì)白藜蘆醇的平均吸附速率為13.9 μg/(g·min)。

2.2.2 吸附等溫線 分別在293，303，313 K三個(gè)溫度下，進(jìn)行等溫吸附，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 LS-303樹脂等溫吸附曲線Fig.2 Curve of adsorption isotherms of LS-303

分別用Freundlich吸附等溫式和Langmuir吸附等溫式對(duì)圖2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，用Freundlich等溫式擬合的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.96，用Langmuir等溫式擬合的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.97，說(shuō)明可用Freundlich方程和Langmiur方程描述LS-303樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸附等溫線，且用Freundlich等溫式擬合的1/n值＜1，說(shuō)明為較好吸附。

2.2.3 靜態(tài)解吸 用乙醇-水溶液進(jìn)行靜態(tài)解析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，乙醇濃度越高，解吸率越高，最終選擇的乙醇濃度為60%。靜態(tài)解吸達(dá)到平衡所用時(shí)間為60 min。

2.2.4 動(dòng)態(tài)吸附與解吸 50 mL濃度為50μg/mL白藜蘆醇溶液以4.0 mL/min的流速流過(guò)吸附柱，吸附率 ＞99.0%;用 50 mL 60% 乙醇，以4.0 mL/min的流速解吸負(fù)載柱，解吸率為82.5%。白藜蘆醇在LS-303大孔樹脂吸附柱上的穿透曲線和解吸曲線見(jiàn)圖3、圖4。

表2 LS-303大孔樹脂吸附白藜蘆醇的Freundlich和Langmuir等溫吸附方程擬合Table2 Freundlich and Langmuir isotherm equation fit of LS-303 macroporous resin adsorption resveratrol

圖3 穿透曲線Fig.3 Break through curve

圖4 解吸曲線Fig.4 Desorption curve

2.3 虎杖白藜蘆醇提取液的純化

純化前后白藜蘆醇溶液高效液相色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 虎杖白藜蘆醇提取原液液相色譜圖Fig.5 LC spectrum of resveratrol extraction from Polygonum cuspidatum

圖6 純化后白藜蘆醇溶液高效液相色譜圖Fig.6 LC spectrum of resveratrol after purification

保留時(shí)間2.7 min為白藜蘆醇峰，7.5 min左右為雜質(zhì)峰。對(duì)比圖5和圖6可知，虎杖白藜蘆醇提取液經(jīng)LS-303大孔樹脂純化后，雜質(zhì)峰相對(duì)面積明顯降低，白藜蘆醇得以純化。

3 結(jié)論

(1)虎杖中白藜蘆醇提取的工藝條件為:溫度70℃，用70%體積分率的乙醇，固液比2 g/100 mL，恒溫浸提2 h。白藜蘆醇的一次提取率約為88.5%。

(2)LS-303大孔吸附樹脂對(duì)白藜蘆醇具有良好的吸附性能。90 min內(nèi)，LS-303樹脂對(duì)白藜蘆醇的平均吸附速率為13.9μg/(g·min);吸附熱力學(xué)曲線可用Freundlich方程和Langmuir方程描述。吸附在樹脂上的白藜蘆醇可用60%乙醇解吸。

(3)虎杖白藜蘆醇提取液經(jīng)LS-303大孔吸附樹脂柱純化后，高效液相色譜檢測(cè)證明，雜質(zhì)含量顯著降低。

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