藥敏試驗(yàn)在魚病防治中的應(yīng)用

仲崇艷

（滁州市水產(chǎn)研究所，安徽 滁州 239074）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)環(huán)境惡化和其它多種原因?qū)е录?xì)菌性疾病日益增多。由于養(yǎng)殖戶缺乏對魚病的正確認(rèn)識(shí)而濫用藥物，增加了細(xì)菌的耐藥性，使得抗菌藥對細(xì)菌性疾病的防治效果不理想，不但造成藥物浪費(fèi)，而且延誤病情。對疾病做出正確診斷，對癥下藥，對致病菌做藥敏試驗(yàn)是最科學(xué)的方法。按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，至少需1周～2周時(shí)間。對養(yǎng)殖戶來說，一旦魚發(fā)生病害，應(yīng)及時(shí)防治，減少損失。

測定抗菌藥物在體外對微生物有無抵制作用的方法稱為藥物敏感性試驗(yàn)，簡稱藥敏試驗(yàn)。KB法，即通常所說的紙片擴(kuò)散藥敏試驗(yàn)，是目前臨床上最常用的藥敏試驗(yàn)方法。其技術(shù)上簡單易行，重復(fù)性好;試驗(yàn)成本相對較低，不需要特殊設(shè)備;抗菌藥物的選擇有很大的靈活性;藥敏結(jié)果解釋性分類（S、I、R）易理解［1］。經(jīng)典的藥敏試驗(yàn)選擇的是M-H培養(yǎng)基［1］，也有選擇肉膏-胰胨培養(yǎng)基［2］，而關(guān)于LB培養(yǎng)基應(yīng)用于藥敏試驗(yàn)鮮有報(bào)告。以鳊為例就LB培養(yǎng)基應(yīng)用于藥敏試驗(yàn)（K-B法）進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基［2］:蛋白胨1%，酵母膏1%，氯化鈉0.5%，pH值7.2;121℃20min。LB固體培養(yǎng)基是在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%～2.0%的瓊脂，121℃20min。

1.1.2 藥敏試紙

購自杭州微生物試劑有限公司（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):WS/T125-1999）

1.1.3 0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度［1］

將0.5mL0.048moL/L的BaCl2（1.175%W/VBaCl2·2H2O）加入到 99.5mL0.18moL/L的H2SO4（1%W/V）中并不斷攪動(dòng)，以維持混懸狀態(tài)。

1.1.4 病魚

取自安徽滁州市某水庫急性發(fā)病的鳊（非缺氧、機(jī)械損傷，中毒與藥害導(dǎo)致的死亡）。

1.2 方法

1.2.1 LB藥敏平板的制作

將滅過菌的LB固體培養(yǎng)基放在無菌操作臺(tái)中，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到60℃左右時(shí)，倒平板（90mm培養(yǎng)皿，每皿注入培養(yǎng)基約20 mL）晾干備用。

1.2.2 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的制作［1］

0.5麥?zhǔn)媳葷峁芟鄬Φ木鷶?shù)為1.5×109CFU/mL，為標(biāo)準(zhǔn)參照物，直接購買或配制（1%Bacl20.5 mL，1%H2SO49.5 mL）。

1.2.3 K-B紙片法的具體步驟

按國家標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行［1］。

1.2.4 直接藥敏試驗(yàn)（又稱一步法藥敏試驗(yàn)）［4］

用70%的酒精棉球擦拭病魚體表，用消毒過的解剖剪，分別取肝臟和腎臟等組織勻漿液0.2mL涂藥敏平板，按K-B紙片法的具體步驟做藥驗(yàn)試驗(yàn)。

1.2.5 富集培養(yǎng)藥敏法（增菌培養(yǎng)后再作藥敏）

將鳊病變的腎臟與肝臟組織勻漿液接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的試管或離心管中，36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～9h進(jìn)行增菌培養(yǎng)后做藥敏試驗(yàn)。

1.2.6 致病菌純培養(yǎng)后的藥敏試驗(yàn)

通過稀釋法，將純培養(yǎng)后致病菌液的濃度調(diào)整到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛龋?xì)菌濃度約為1.5×108/mL）;取0.2mL涂藥敏平板，按K-B紙片法的具體步驟做藥敏試驗(yàn)。

1.2.7 抑菌試驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)試驗(yàn)抑菌圈結(jié)果，并針對不同的抗生素、菌株參考NCCLS標(biāo)準(zhǔn)或CSLI標(biāo)準(zhǔn)，做出判斷。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 直接法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

見表1。

表1 直接法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 富集法培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

見表2。

表2 富集法培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 致病菌純培養(yǎng)后藥敏結(jié)果

見表3。

表3 致病菌純培養(yǎng)后藥敏結(jié)果

3 討論

以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過用直接法、富集法、致病菌純培養(yǎng)后3種方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):這3種方法試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，在實(shí)踐中可根據(jù)需要靈活運(yùn)用。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《無公害食品漁藥藥物使用準(zhǔn)則》中規(guī)定環(huán)丙氟派酸等藥物屬于禁止用漁藥，可選擇其他幾種藥物使用。本試驗(yàn)選用了藥物中的諾氟沙星拌料投喂后兩天便控制了病情，效果顯著。

耐藥菌株的產(chǎn)生是魚病防治的一大難題，臨床準(zhǔn)確用藥，快速的藥敏報(bào)告是前提基礎(chǔ)。該技術(shù)簡單易行，不需要特殊的儀器設(shè)備，重復(fù)性好［1］。對指導(dǎo)魚類病害防治，降低用藥成本，有重要作用，可積極推廣。

［1］倪語星，王金良，徐英春，等.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)規(guī)范［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社:17-26.

［2］周德慶，微生物實(shí)驗(yàn)教程（第2版）［M］:2006.3.

［3］廖詩英，張世卿.雞大腸桿菌TTC快速藥敏試驗(yàn)方法的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）;206.

［4］崔晨光，崔彥剛，邵素云.一步法藥敏試驗(yàn)在臨床診斷上的應(yīng)用［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2010（1）.

［5］李先斌，莫麗亞，趙蕊，等.用顯色半固體進(jìn)行快速細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的方法［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006.13.（2）;443-444.

［6］陳淑蘭，宋熙瑤，董娟，劉文博，趙金英.控制影響細(xì)菌藥敏試驗(yàn)（K-B法）質(zhì)量的各因素［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)報(bào)，1999年（2），157-158.