Mdivi-1對糖氧剝奪后神經元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及細胞色素C釋放的影響

崔梅，楊琦，董強

Mdivi-1對糖氧剝奪后神經元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及細胞色素C釋放的影響

崔梅，楊琦，董強

目的：研究線粒體分裂蛋白抑制劑Mdivi-1對糖氧剝奪（OGD)后神經元凋亡蛋白Bax活化、嵌入及細胞色素C（CytC）釋放的影響。方法：體外培養(yǎng)原代皮質神經元并制備OGD模型，采用不同濃度的Mdivi-1干預細胞，MTT測定神經元存活率。之后采用10μmol/LMdivi-1干預細胞，免疫共沉淀或細胞堿處理后測定細胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入情況。抽提線粒體和細胞漿蛋白，Western Blot測定線粒體內CytC釋放情況。結果：Mdivi-1可以劑量依賴地改善OGD后神經細胞的存活，10μmol/LMdivi-1干預可以減少凋亡蛋白Bax的激活和嵌入，并且減少CytC的釋放。結論：線粒體分裂蛋白抑制劑Mdivi-1在OGD后具有明確的神經保護作用，其機制可能和其抑制細胞凋亡有關。

氧糖剝奪；神經元；線粒體；凋亡蛋白Bax；細胞色素C

dong_qiang@fudan.edu.cn

線粒體功能障礙與諸多神經系統(tǒng)疾病之間有著深入的聯(lián)系，其中線粒體動力學機制和線粒體分裂融合失衡為眾人所關注。目前有研究報導，在眾多神經變性疾病和缺血性腦血管病中，線粒體存在動力學障礙和過度分裂的現象。抑制線粒體分裂蛋白Drp1是一種潛在的腦缺血治療靶點[1-3]。近期的研究表明在體外模型中Drp1的小分子抑制劑Mdivi-1可預防由谷氨酸引起的線粒體片段化、線粒體膜電位崩解和細胞凋亡，進一步在動物實驗中發(fā)現這種小分子抑制劑可以減輕谷氨酸和缺血損傷引起的毒性和梗死體積，這顯示線粒體分裂蛋白Drp1在急性缺血性損傷中扮演重要角色[4]。線粒體在細胞凋亡過程中的核心作用已得到廣泛認可。線粒體的融合分裂與細胞凋亡也存在密切關系，在多種細胞凋亡的模型中都發(fā)現線粒體的過度分裂。有研究表明，線粒體的過度分裂發(fā)生在凋亡早期，大概與凋亡蛋白Bax從細胞漿轉位到線粒體同時，早于凋亡因子Caspase的釋放。而線粒體分裂蛋白Drp1過度表達可促進線粒體的分裂及細胞色素C（cytochrome C，CytC）的釋放，表明Drp1在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[5,6]。本研究在原代培養(yǎng)的神經元中制備糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）的細胞模型，采用Drp1的小分子抑制劑Mdivi-1干預細胞，檢測Mdivi-1對腦缺血后線粒體凋亡蛋白Bax寡聚、嵌入及線粒體外膜通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生SD大鼠購自復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 Neurobasal A、DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司；多聚賴氨酸、MTT試劑盒購自美國Sigma公司；免疫共沉淀試劑盒購自美國Invitrogen公司；蛋白質濃度檢測試劑盒、線粒體抽提試劑盒購自美國Pierce公司；抗Bax抗體購自美國M illipore公司；抗Cyt、抗tublin抗體購自美國BD Bioscience公司；抗HSP60抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 原代神經元的培養(yǎng) 出生24 h內新生鼠置于超凈臺，用75%酒精消毒皮膚后，斷頭取腦，放入冰預冷的D-Hanks液中。仔細去除腦膜和血管，分離的皮質收集于裝有DMEM高糖培養(yǎng)液的離心管中，用巴氏滴管吹打至細胞分散。制成的細胞懸液于4℃1 000 rpm離心5min，棄上清，沉淀重懸于神經元種植液（DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清），顯微鏡下調整細胞密度。根據實驗需要，以1×105/L的密度種植于L-多聚賴氨酸（0.1mg/m L）包被的相應培養(yǎng)容器中，放入95%O2/5%CO2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。次日將培養(yǎng)液更換為神經元培養(yǎng)液（neurobasalA+2%B27+0.5mmol/L谷氨酰胺+1%青霉素和鏈霉素），之后每隔3～4 d換半液，取培養(yǎng)第10天的神經元進行實驗。

1.2.2 OGD模型的制備 取原代培養(yǎng)至第10天的神經元，傾盡培養(yǎng)液，更換為預先用 5%CO2、10%H2和 85%N2飽和的DMEM無糖培養(yǎng)基。將細胞置于厭氧培養(yǎng)箱內，通入 5%CO2、10%H2和 85%N2，使箱內氧濃度＜1%。培養(yǎng)90min后將培養(yǎng)液更換為神經元培養(yǎng)液，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。

1.2.3 細胞存活率的測定 種植于96孔培養(yǎng)板的神經元隨機分為OGD-組和OGD+組。2組神經元分別在正常培養(yǎng)后的 第 9 天 加 入 不 同 濃 度（0、5、10、20μmol/L）的 Mdivi-1干預，第 10天OGD組置缺氧箱90min，再復氧4 h。取出各組神經元，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL 0.5mg/m L的MTT溶液，于37℃溫箱顯色4 h，棄上清，加入DMSO充分溶解紫藍色結晶。以DMSO為空白，酶標儀570 nm處測量各孔吸光度（A）值。按照公式計算神經元存活率：神經元存活率=實驗組A值/正常對照組A值×100%。

1.2.4 免疫共沉淀測定活性Bax將神經元以5×105個/cm2的密度種植于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)后的第9天給予Mdivi-1處理，第10天OGD+組置缺氧箱90min，再復氧4 h。各干預組常規(guī)收集細胞，PBS清洗2次，PMSF裂解液加 1×protease inhibitor cocktail setⅠ裂解細胞，Bradford法蛋白質定量，用PBS將總蛋白稀釋到約1 g/L，加入 1μg抗 Bax（NT）抗體到 500μL總蛋白中，室溫下緩慢搖動抗原抗體混合物2 h后，加入100μL蛋白A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物。室溫緩慢搖動抗原抗體混合物1 h后，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的裂解液洗3遍，將上樣樣品煮5m in，以游離抗原、抗體、珠子，離心，將上清按照Western blot的技術介紹進行電泳和轉膜，最后加入抗活性Bax抗體進行檢測。

1.2.5 細胞堿處理測定Bax的嵌入 神經元以5×105個/cm2的密度種植于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)后的第9天給予Mdivi-1處理，第10天OGD+組置缺氧箱90min，再復氧4 h。分別收集各組細胞，采用0.05%洋地黃皂苷干預細胞，使其釋放細胞漿蛋白，其余細胞組分在PBD洗滌后，加入0.1mol/LNa2CO3在pH值11.5的堿性環(huán)境下干預30min。在100 000 g下超速離心1 h，收集沉淀，按照Western blot的技術介紹進行電泳和轉膜，最后加入抗Bax抗體進行檢測。

1.2.6 CytC釋放的測定 神經元以5×105個/cm2的密度種植于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)后的第9天給予Mdivi-1處理，第10天OGD+組置缺氧箱90min，再復氧4 h。分別收集各組細胞，采用線粒體抽提試劑盒抽提線粒體。上清液100 000 g超速離心1 h后，再次提取上清液作為細胞漿蛋白Bradford法蛋白質定量。取適量蛋白質，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳分離（BIO-RAD電泳及轉膜裝置）2 h，電轉膜（100 V，1 h）至硝酸纖維素膜，印跡膜在含有5%封閉蛋白的TBS-T緩沖液中封閉1 h，在CytC tublin或HSP60的一抗溶液（抗體用5%封閉蛋白的TBS-T緩沖液1∶1 000稀釋）中4℃孵育過夜，次日加入二抗，ECL化學發(fā)光法進行測定。

1.3 統(tǒng)計學處理

每個實驗至少重復3次，計量資料以（均數±標準差）表示，組間比較采用one-way ANOVA，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Mdivi-1可有效減少OGD所導致的神經元死亡

MTT結果表明，OGD可顯著降低神經元的存活率，應用線粒體分裂蛋白Drp1抑制劑Mdivi-1可增加OGD后神經元的存活率，與OGD+組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。并且，Mdivi-1在抑制OGD所導致的神經元死亡方面，具有劑量依賴性，10μmol/L是其最佳干預劑量，見圖1。

2.2 Mdivi-1可有效抑制OGD后細胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入

圖1 Mdivi-1對OGD后神經元細胞存活率的影響

通過免疫共沉淀技術測定細胞凋亡蛋白Bax的活化提示，在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，神經元內活化的Bax含量極低，難以檢測。在OGD干預后，活化Bax的含量顯著增加；Mdivi-1干預可明顯抑制OGD后細胞凋亡蛋白的活化，與對照相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞堿處理可以將疏松附著在線粒體表面的蛋白剝離并洗脫。在超速離心后，所得的線粒體沉淀可檢測到嵌入線粒體的蛋白，Bax的特異性抗體檢測嵌入到線粒體的Bax結果顯示，在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，神經元內嵌入線粒體的Bax含量較低，在OGD干預后，嵌入線粒體的Bax含量顯著增加；Mdivi-1干預可明顯減少OGD后細胞凋亡蛋白Bax的嵌入，與對照相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，見圖 2。

2.3 Mdivi-1可明顯減少OGD后Cyt C的釋放

Western Blot分別檢測線粒體和細胞漿中的CytC含量，結果顯示，在OGD干預后，細胞漿內的CytC含量顯著增高，同時伴隨著線粒體內的CytC顯著下降，這意味著Cyt C從線粒體向細胞漿的釋放增多。Mdivi-1干預后，細胞漿內的Cyt C含量明顯減少，線粒體內的CytC濃度提高，表明Mdivi-1可顯著抑制OGD后CytC的釋放過程，見圖3。

3 討論

線粒體分裂蛋白Drp1主要分布于細胞漿內，在細胞受到某些損傷性刺激后，Drp1可由細胞漿向線粒體外膜發(fā)生細胞內轉位，遷移至線粒體外膜的Drp1可與分布與線粒體外膜的線粒體分裂蛋白hFis發(fā)生相互作用，從而誘導線粒體斷裂[3，4]。筆者的前期研究結果表明，OGD 可顯著誘導神經元內線粒體發(fā)生過度斷裂，且這一過程和Drp1由細胞漿向線粒體轉位密切相關[7]。本研究表明在OGD干預后，神經元內確實存在Drp1由細胞漿向線粒體的轉位過程。既往研究表明，在使用星形孢菌素誘導細胞凋亡時，Drp1會從細胞漿轉位到線粒體成點狀聚集，與Bax共定位于線粒體外膜上，通過siRNA下調Drp1表達可以Bax的移位增加而CytC的釋放被抑制[8]。盡管Drp1的表達下調能夠抑制線粒體的分裂并部分阻止Cyt C釋放，但Estaquier等[9]的研究卻發(fā)現，Drp1的表達下調不能阻止那些可以引起Caspase激活和隨后的細胞凋亡過程的其它輔助因子，如Omi/HtrA2、腺苷酸激酶2等。還有研究發(fā)現，當用化學抑制劑Mdivi-1抑制Drp1后，也能夠阻止tBid誘導的依賴于Bax/Bak的Cyt C從線粒體釋放，而此過程不涉及線粒體分裂[6]，暗示Drp1可能的促凋亡作用也許與調節(jié)線粒體分裂無關。

圖2 Mdivi-1可以有效抑制OGD后細胞凋亡蛋白Bax的活化和嵌入

圖3 Mdivi-1可明顯減少OGD后CytC的釋放

細胞凋亡是正常細胞分化、有毒物質致細胞損傷后清除中的重要步驟。在心腦疾病、腫瘤及自身免疫疾病等，組織內細胞凋亡調節(jié)存在失衡。近來研究指出，許多引起凋亡的因素可引起B(yǎng)ax和僅有BH3（Bcl-2 homology 3）結構域的 tBid 或Bim等從細胞漿至線粒體轉移定位并有線粒體膜電位的改變和磷酸化，從而發(fā)生細胞凋亡。Bax平時存在于細胞漿，為無活性的單體結構，細胞發(fā)生凋亡時重新分布。在生物或病理因素刺激下，細胞漿Bax構象發(fā)生改變，繼而從細胞漿向線粒體轉位，結合于線粒體膜時則為二聚體或多聚體的活性分子。Bax的寡聚化可能同樣是由于其構象改變所致，Bax N端和BH3結構域暴露后可促進其寡聚體的形成。在線粒體外膜上的Bax形成寡聚體，導致線粒體外膜滲透性轉運孔打開，線粒體外膜通透性增高。存在于線粒體間隙的Cyt C等物質釋放，從而導致細胞凋亡[10，11]。

Mdivi-1是一種脂溶性物質，有文獻表明其可以迅速滲透入細胞膜，且可以透過血腦屏障。在神經系統(tǒng)變性疾病中，Mdivi-1可通過抑制線粒體分裂蛋白Drp1的GTP酶活性，抑制線粒體的過度斷裂功能。在帕金森病模型中，Mdivi-1干預可顯著減少細胞死亡，重建多巴胺能神經元內線粒體分裂/融合的平衡，并改善線粒體的功能[12]。本研究結果提示，Mdivi-1可顯著減少OGD所誘導的神經元死亡，其機制可能為抑制線粒體分裂蛋白Drp1分裂蛋白的GTP酶活性，繼而干預Drp1和細胞凋亡蛋白的Bax的相互作用，從而使Bax從細胞漿至線粒體的轉位和嵌入明顯減少，Bax活化障礙。因此在OGD處理后，采用Mdivi-1干預，可顯著降低細胞內線粒體外膜的通透性，從而使細胞凋亡前體蛋白Cyt C的釋放顯著減少。

綜上所述，在OGD后抑制Drp1不僅可改善線粒體的形態(tài)，重建線粒體動態(tài)平衡，而且可有效干預細胞凋亡，使細胞凋亡前體蛋白釋放減少。對Drp1的有效干預，可能會成為未來治療缺血性腦血管病的一個重要靶點。

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M d ivi-1 M ed iates Apop totic Protein Bax Insertion Activation and Cytoch rom e C Release on

Oxygen and Glucose Dep rived Cortical Neu rons

CUIMei,YANG Qi,DONG Qiang.Department of Neurology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai200040

Objective：To study the effectofmitochondrial fission protein inhibitorMdivi-1 on apoptotic protein Bax activation insertion and cytochrome C release of oxygen and glucose deprived cortical neurons.Methods:Primary cultured cortical neuronswere treated with different doses of Mdivi-1 after oxygen-glucose deprivation procedure.MTT was used to evaluate the cell viability.A fter OGD treatment the neurons were treated with 10μmol/L Mdivi-1,co-immunoprecipitation or alkali treatment were used to determine Bax activation and insertion.Mitochondrial and cytosolic fraction proteins were extracted,Western Blot was used to detect the cytochrome C release.Results:Mdivi-1 significantly improved cellviability in a dose-dependentmanner.Mdivi-1 blocked apoptotic protein Bax insertion and activation and subsequent cytochrome C release induced by OGD.Conclusion:Mitochondrial fission protein inhibitor Mdivi-1 has a neuroprotective effect on neurons after OGD,probablymediated by anti-apoptotic effects.

oxygen glucosedeprivation;neurons;mitochondria;apoptotic protein Bax;cytochrome C

R741;R741.02

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.03.001

復旦大學附屬華山醫(yī)院神經內科 上海200040

國家自然科學基金（No.81000487，81171 023）； 上海市科委課題 （No.11QA1400900）

2014-01 -01

董強