碳納米管/納米金復(fù)合膜電化學(xué)免疫傳感器用于微囊藻毒素的檢測(cè)研究

張新愛　申建忠　張帆　馬海樂　韓恩　董曉婭

摘要利用核酸適配體特異的分子識(shí)別功能以及特定熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移，建立了一種高靈敏度、高選擇性測(cè)定雌二醇的光譜方法。研究了緩沖溶液的pH值、組成和濃度、核酸濃度、實(shí)驗(yàn)溫度及響應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)檢測(cè)雌二醇的影響。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下（50 mmol/L BR緩沖溶液（pH 7.4），1.0×10mol/L核酸，實(shí)驗(yàn)溫度45 ℃，響應(yīng)時(shí)間19 min），體系熒光強(qiáng)度的改變值ΔI與雌二醇濃度的對(duì)數(shù)lgC呈良好的線性關(guān)系（r=0.9953），線性范圍為1.0×10將本方法用于檢測(cè)人體尿液中雌二醇的含量，雌二醇的加標(biāo)回收率為94.0%～103.5%。

關(guān)鍵詞適配體； 熒光共振能量轉(zhuǎn)移； 雌二醇

1引言

雌二醇（17 βEstradiol）是一種天然類固醇雌激素，影響性特征的發(fā)展，在許多生理過程中起著至關(guān)重要的作用＼[1＼]。同時(shí)它也是一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可與共存的雌激素發(fā)生協(xié)同作用，促使雌激素活性增強(qiáng)＼[2，3＼]。雌二醇在人體的含量與乳腺癌等疾病有很大相關(guān)性，即使在很低的濃度下也有毒性或致癌作用＼[4＼]。

目前，雌二醇的檢測(cè)技術(shù)主要分為三類：（1）色譜法，包括高效液相色譜法（HPLC）＼[5，6＼]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）＼[7，8＼]，以及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）＼[9＼]，色譜法準(zhǔn)確、可靠，但需要復(fù)雜的儀器，檢測(cè)成本高，樣品預(yù)處理復(fù)雜費(fèi)時(shí)，衍生化還會(huì)造成目標(biāo)類固醇的損失或降解，因此色譜法難以對(duì)大量樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求； （2）免疫學(xué)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）＼[10＼]、化學(xué)發(fā)光免疫法（CLEIA）＼[11＼]、熒光標(biāo)記免疫法＼[12＼]等，這類方法基于抗原抗體特異性相互作用從而具有很高的選擇性，但因天然抗體穩(wěn)定性較差，免疫法容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果； （3）電化學(xué)分析方法＼[13，14＼]，具有分析速度快、易于微型化、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，但該技術(shù)多基于對(duì)電極表面的修飾，大都存在修飾層穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差、傳質(zhì)和電荷傳遞速率慢、選擇識(shí)別能力差等問題。

核酸適配體（Aptamer）是一段體外通過配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選獲得的寡核苷酸片段，可以是RNA 或單鏈DNA。單鏈寡核苷酸的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等，可使核酸分子形成多種三維結(jié)構(gòu)，成為與靶標(biāo)物質(zhì)特定區(qū)域結(jié)合的基礎(chǔ)。適配體能與DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及其它小分子靶物質(zhì)特異性結(jié)合，具有親和力高、特異性強(qiáng)、容易制備及修飾、穩(wěn)定性好等特性，常被用于制備各種適配體傳感器＼[15＼]。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET） ＼[16＼]是指在不同的熒光基團(tuán)中，若一個(gè)熒光基團(tuán)（供體）的熒光發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)間的距離合適時(shí)（一般小于10 nm），即可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即供體熒光猝滅和受體熒光增強(qiáng)。本研究以雌二醇適配體（P1）作為供受體之間的橋聯(lián)媒介，在適配體的兩條互補(bǔ)鏈（F1和F2）末端分別修飾上羧基熒光素（FAM）和羧基四甲基羅丹明（TAMRA），其中FAM作為熒光供體，TAMRA作為受體，用FRET法檢測(cè)雌二醇，實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。當(dāng)適配體P1不存在時(shí)，互補(bǔ)鏈F1FAM和F2TAMRA游離在溶液中（圖1a）；向溶液中加入P1與F1和F2上堿基充分雜交后，F(xiàn)AM和TAMRA距離靠近，發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移（圖1b）；再加入目標(biāo)物雌二醇，雌二醇與P1特異性的結(jié)合使F1和F2重新游離出來（圖1c），F(xiàn)AM熒光恢復(fù)。從而建立一種基于適配體FRET的高靈敏度及選擇性的檢測(cè)方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

F4600型熒光光譜儀（日本日立公司），10 mL石英檢測(cè)池（Lightpath Optical Ltd.， UK），雷磁PHS3C精密酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），5804型離心機(jī)（德國Eppendorf公司），HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

3結(jié)果與討論

3.1FRET現(xiàn)象

當(dāng)適配體P1不存在時(shí)，F(xiàn)AM標(biāo)記的F1和TAMRA標(biāo)記的F2鏈游離在溶液中，在485 nm的激發(fā)波長下，只能檢測(cè)到FAM在520 nm處的熒光（圖2a）；向溶液中加入P1充分雜交后，520 nm處FAM的熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)在580 nm處出現(xiàn)TAMRA明顯的發(fā)光（圖2b）；再加入雌二醇與P1特異性結(jié)合后，引起520 nm發(fā)射光增強(qiáng)、580 nm發(fā)射光降低（圖2c）。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，雌二醇對(duì)FAM沒有明顯的熒光增強(qiáng)作用

對(duì)TAMRA也無明顯的淬滅作用，說明FAM熒光增強(qiáng)是由于雌二醇與適配體P1結(jié)合導(dǎo)致F1和F2游離出來引起的。鑒于520 nm處的發(fā)射光比580 nm處的發(fā)光更靈敏，故以520 nm處熒光強(qiáng)度的改變?chǔ)作為定量依據(jù)。

3.2實(shí)驗(yàn)條件對(duì)發(fā)光的影響

3.2.1緩沖溶液的pH值、種類和濃度的影響FAM和TAMRA間能否發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移主要取決于適配體與其互補(bǔ)鏈的堿基配對(duì)，而堿基配對(duì)受pH的影響顯著，與緩沖介質(zhì)的種類及濃度也相關(guān)

體系為研究對(duì)象，探討上述因素的影響。研究表明，在相同濃度下，與PBS緩沖液、TrisHCl緩沖液、NaHCO3Na2CO3緩沖液相比，在BR緩沖液中熒光信號(hào)最強(qiáng)且穩(wěn)定。改變BR的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，濃度為50 mmol/L 時(shí)熒光最強(qiáng)。向體系中加入雌二醇，記錄不同pH值下ΔI值，結(jié)果表明，pH 7.4時(shí)可獲得最大的ΔI值。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇pH 7.4的50 mmol/L BR緩沖溶液作為分析底液。

3.2.2核酸濃度的影響

分別測(cè)定適配體P1與其互補(bǔ)鏈F1和F2濃度為5.0×10， 1.0×10 mol/L時(shí)體系發(fā)光情況。隨著核酸濃度增加，F(xiàn)1/F2/P1體系發(fā)光強(qiáng)度迅速增加，當(dāng)核酸濃度高于1.0×10 mol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度增加幅度降低，考慮本底發(fā)光強(qiáng)度較大會(huì)增大實(shí)驗(yàn)誤差，且高濃度下堿基錯(cuò)配的幾率增大，故選擇1.0×10mol/L作為最佳核酸濃度。在此濃度下FAM的發(fā)光強(qiáng)度能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要，且加入雌二醇溶液后520 nm處熒光改變值ΔI最大。

3.2.3實(shí)驗(yàn)溫度的影響溫度決定核酸鏈雜交的速率和雜交雙鏈的穩(wěn)定性。分別記錄25， 30， 35， 40， 45， 50和60 ℃下F1/F2/P1/雌二醇體系的熒光強(qiáng)度。隨溫度升高，熒光呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，45 ℃時(shí)熒光最強(qiáng)。推測(cè)溫度不僅影響核酸的構(gòu)型，同時(shí)也影響供體FAM的熒光效率，溫度升高FAM熒光效率下降，導(dǎo)致向受體TAMRA轉(zhuǎn)移的能量降低＼[18＼]。因此選擇45 ℃作為最佳工作溫度。

3.2.4熒光體系的響應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定性研究

分別考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F1/F2/P1體系以及加入雌二醇后發(fā)光強(qiáng)度的影響。向F1/F2溶液中加入P1后，在0～15 min內(nèi)，520 nm處熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸降低，580 nm處熒光強(qiáng)度逐漸增大， 15 min以后熒光幾乎不再變化，說明適配體P1與其互補(bǔ)鏈F1和F2已雜交完全。再向該體系中加入雌二醇，520 nm處熒光增大，4 min后達(dá)穩(wěn)定，說明適配體P1能夠快速地識(shí)別雌二醇，顯示P1與雌二醇之間高的親和性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在20 min內(nèi)能夠完成對(duì)體系熒光變化的測(cè)定。

將含有F1/F2/P1/雌二醇的BR緩沖溶液密封，在4 ℃避光儲(chǔ)存，2天后檢測(cè)，熒光信號(hào)沒有顯著的變化； 5天后，熒光強(qiáng)度下降5.8%，表明此體系具有良好的穩(wěn)定性，能夠彌補(bǔ)不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的不足。

另外，對(duì)儀器參數(shù)也進(jìn)行了優(yōu)化，選擇光電倍增管高壓為700 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。

3.3雌二醇的線性響應(yīng)范圍和檢出限

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)不同濃度的雌二醇對(duì)1.0×10

mol/L的發(fā)光體系平行測(cè)定5次，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.3%。與雌二醇常用檢測(cè)方法的對(duì)比結(jié)果（表1）表明，本方法將適配體的特異性識(shí)別與FRET技術(shù)結(jié)合，具有較高的靈敏度和分析效率。mol/L雌二醇的發(fā)光體系， 當(dāng)控制熒光強(qiáng)度變化在±5%以內(nèi)，1000倍的CaCl2， MgCl2， KH2PO4， Na2SO4， NaCl， KNO3和NH4Cl，450倍的肌酸酐、葡萄糖、果糖，300倍的尿素、L酪氨酸、L組氨酸、L賴氨酸、L纈氨酸、甘氨酸，200倍的尿酸、抗壞血酸，50倍的Al3+、Fe3+（50倍），25倍的Pb2+、Cd2+、Ni2+、Hg2+對(duì)體系沒有干擾。重金屬離子對(duì)該發(fā)光體系的干擾稍大，推測(cè)重金屬離子與核酸結(jié)合后，使核酸構(gòu)型改變，單鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，阻礙適配體與互補(bǔ)鏈堿基配對(duì)，引起FAM與TAMRA之間距離改變，不利于兩者之間熒光能量轉(zhuǎn)移。實(shí)際樣品中重金屬離子含量遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)所用濃度。因此，本方法具有較好的選擇性和抗干擾能力。

3.5實(shí)際樣品分析

將本方法用于人體尿液中雌二醇含量的檢測(cè)，樣品取自5名志愿者，未經(jīng)任何前處理直接檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次取其平均值，結(jié)果在5.9×10

Symbolm@@ 10 mol/L之間，均在正常值范圍內(nèi)，如表2所示，在每個(gè)樣品中加入雌二醇進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.3%～6.7%， 回收率為94.0%～103.5%。由此可見，本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，適合實(shí)際樣品分析。4結(jié)論

本研究利用核酸適配體對(duì)目標(biāo)分子特定的識(shí)別能力，結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測(cè)定雌二醇，實(shí)驗(yàn)表明，本方法能夠抵抗高濃度無機(jī)鹽、糖類、氨基酸、尿酸等生理體系中共存物質(zhì)的干擾，具有較高的靈敏度、選擇性、重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性，適合實(shí)際樣品分析，為小分子檢測(cè)提供了一種新思路。

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18Liu H L， Wang Y H， Shen A G， Zhou X D， Hu J M. Talanta， 2012， 93（15）： 330-335

AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10

mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.

KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol

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AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10

mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.

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AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10

mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.

KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol