氧化硅介孔材料在基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析有機(jī)小分子中的應(yīng)用

董美花　孫士美　金彪

摘要研究了表面修飾的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合型介孔材料SBA15NA（1，8Naphthalimide）作為基質(zhì)在MALDITOFMS分析中的應(yīng)用。采用1，8萘酰亞胺修飾SBA15，1，8萘二甲酸酐先與3三甲氧基硅基1丙胺反應(yīng)，得到的產(chǎn)物再修飾到SBA15，得到SBA15NA，應(yīng)用修飾后的介孔材料SBA15NA為基質(zhì)獲得了具有背景離子干擾少、離子化效率高、更高的峰值強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)的譜圖。甲醇作為溶劑，分析物和基質(zhì)的濃度比例為1∶10，采用以樣品和基質(zhì)等體積混合均勻點(diǎn)樣方法，對(duì)低糖類、氨基酸類、植物激素生物代謝物和藥物等不同結(jié)構(gòu)的小分子化合物（分子量小于500）進(jìn)行了MALDITOFMS分析。在此優(yōu)化的條件下得到了低檢出限1×10

1引言

代謝物組學(xué)是在生命科學(xué)研究中發(fā)展起來(lái)的一種新興技術(shù)，它重點(diǎn)研究生物體系的內(nèi)源性和外源性代謝物濃度及其動(dòng)態(tài)變化，主要研究對(duì)象是分子量小于1000的小分子化合物。目前，常用的主要研究手段是NMR＼[1＼]， GCMS＼[2＼]， LCNMR＼[3＼]， LCNMRMS＼[4＼]和數(shù)據(jù)處理等技術(shù)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的質(zhì)譜離子化新技術(shù)。該技術(shù)成功解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性的生物大分子難以電離問(wèn)題＼[5，6＼]，因此廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域。然而，由于基質(zhì)自身產(chǎn)生的離子嚴(yán)重干擾小分子目標(biāo)物在低分子量區(qū)域（<400 Da）的分析，所以該技術(shù)不能廣泛用于低分子量化合物的分析。為了克服這些問(wèn)題，人們?cè)诨|(zhì)的選擇和改進(jìn)方面進(jìn)行了大量研究。1988年，Tanaka等[6]首次將納米材料作為基質(zhì)引入到MALDITOFMS 分析中成功應(yīng)用30 nm無(wú)機(jī)鈷納米顆粒和甘油混合分析了蛋白質(zhì)溶菌酶。隨后，以多孔硅＼[7＼]、碳納米管＼[8＼]、硅納米粒子＼[9＼]、金納米粒子＼[10＼]等作為基質(zhì)，廣泛應(yīng)用在MALDITOFMS分析技術(shù)中。多種修飾的多孔硅粉和硅膠顆粒用于MALDITOFMS分析小分子化合物＼[11～14＼]。Li等＼[15＼]成功將喹啉修飾到介孔材料SBA15上，將其作為MALDITOFMS的基質(zhì)應(yīng)用到分析低分子量的糖類化合物和天然蜂蜜中。

本研究以1，8萘二甲酰亞胺固定化介孔材料，應(yīng)用表面修飾的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合型介孔材料SBA15NA作為輔助基質(zhì)，進(jìn)行了低糖、氨基酸以及藥物小分子化合物的MALDITOFMS分析。與常用的有機(jī)基質(zhì)（如DHB，CHCA）比較，介孔材料能夠有效克服使用有機(jī)基質(zhì)分析樣品時(shí)帶來(lái)的基質(zhì)信號(hào)干擾問(wèn)題，可以成功實(shí)現(xiàn)小分子化合物的高通量快速分析。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑

SBA15介孔材料（趙東元院士先進(jìn)材料實(shí)驗(yàn)室提供）； 1，8萘二甲酸酐和3三甲氧基硅基1丙胺（北京Aldrich公司）。2，5二羥基苯甲酸（DHB）、α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、肌紅蛋白、糖類、植物激素、藥物、胞嘧啶、肌肽和5氮胞苷（Sigma公司）。氨基酸生化標(biāo)準(zhǔn)試劑（上?？颠_(dá)氨基酸廠）。所有溶劑均為色譜純（Sigma公司）； 超純水由Millipore純水系統(tǒng)制備。尿樣采自志愿者，采集后于

Symbolm@@ 80 ℃保存。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

介孔材料的修飾：在干燥的50 mL兩口瓶中加入100 mg， 0.5 mmol/L 1，8萘二甲酸酐， 20 mL無(wú)水乙醇，升溫至回流，待酸酐全部溶解后，攪拌下滴加等當(dāng)量的3三甲氧基硅基1丙胺，N2保護(hù)下回流反應(yīng)3 h，TLC追蹤反應(yīng)進(jìn)展。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至100 mL單口瓶中，減壓除去無(wú)水乙醇，得微黃色固體M1。向100 mL單口瓶中加入30 mL精制甲苯，待固體全部溶解后，再向其中加入1 g有序硅介孔材料SBA15，N2保護(hù)下回流反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，減壓抽濾，濾餅用甲苯、四氫呋喃、丙酮、氯仿進(jìn)行多次洗滌，除去未反應(yīng)物，所得濾餅在N2保護(hù)下干燥，得微黃色固體SBA15NA，見圖解1。

[TS（][HT5”SS]圖解1SBA15NA 合成路線

分析條件：MALDITOFMS：采用了AXIMACFRTM plus基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)量分析系統(tǒng)（日本島津公司），采用N2激光源，發(fā)射波長(zhǎng)為337 nm。正離子反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍為m/z 50～2000 Da， 每張質(zhì)譜圖由總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為50的質(zhì)譜圖平均累計(jì)產(chǎn)生。在數(shù)據(jù)采集前，用馬心肌肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物，校正儀器的絕對(duì)準(zhǔn)確度至0.1 Da。樣品與基質(zhì)溶液采用混合點(diǎn)樣方法（1 μL點(diǎn)樣）。PRESTIGE21紅外光譜儀（KBr壓片法）， UV2550分光光度計(jì)（島津公司）。

3結(jié)果與討論

3.1介孔材料的修飾

Symbolm@@ 1與羰基相連的CN伸縮振動(dòng)）附近也有吸收， SBA15則沒有這些吸收，表明1，8萘酰亞胺成功接到SBA15上。另外，紫外光譜（圖1B）， SBA15NA在350 nm（1，8 萘酰亞胺的特征吸收）附近有吸收帶， SBA15 則沒有，表明1，8萘酰亞胺成功接到SBA15上。SBA15NA的吸收與傳統(tǒng)的基質(zhì)CHCA吸收在相似位置，這是本合成方法的一個(gè)重要方面，因?yàn)樗剐碌幕|(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的MALDITOF質(zhì)譜儀的激光光源有很強(qiáng)的吸收。3.2低糖分析

MALDITOFMS在糖類的分析中具有良好的應(yīng)用前景＼[15＼]。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)基質(zhì)DHB和新型介孔材料分別作為基質(zhì)進(jìn)行了MALDITOFMS分析。從圖2可見，3種糖類的堿金屬離子加合離子峰在不同基質(zhì)下都可檢測(cè)到，它們分別是D葡萄糖（m/z 203＼[M+Na＼]+、219＼[M+K＼]+），D蔗糖（m/z 365＼[M+Na＼]+， 381＼[M+K＼]+），D木糖（m/z 173＼[M+Na＼]+， 189＼[M+K＼]+）。圖2a出現(xiàn)了DHB的一些明顯的基質(zhì)干擾峰（m/z 177＼[M+Na＼]+， 193 ＼[M+K＼]+），圖2b和2c雜峰少。這說(shuō)明在此基質(zhì)作用下，樣品分子及基質(zhì)分子相當(dāng)穩(wěn)定，在離子化過(guò)程中幾乎不發(fā)生碎裂。這是因?yàn)楫?dāng)1，8萘酰亞胺官能團(tuán)修飾到SBA15的表面后，不易汽化到氣相中變成離子，從而能有效去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾。與圖2b相比，圖2c中3種糖類質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是由于修飾到介孔二氧化硅材料上的1，8萘酰亞胺能夠吸收激光照射，所以SBA15NA比SBA15有更強(qiáng)的光吸收，而且可與樣品溶液充分混勻，所以它更容易促進(jìn)分析物的解吸/電離。

3.3氨基酸的分析

氨基酸的分子量一般小于300 Da，傳統(tǒng)基質(zhì)本身在此分子量區(qū)域產(chǎn)生大量的基質(zhì)干擾使得氨基酸的MALDITOFMS分析變得復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)分別以有機(jī)基質(zhì)CHCA和新型介孔材料分別為基質(zhì)，進(jìn)行氨基酸分析。從氨基酸在不同基質(zhì)下的MALDITOFMS分析結(jié)果（圖3）可知，兩種氨基酸都能檢測(cè)到，它們分別是纈氨酸（Val）

氨基酸在小分子量區(qū)域的檢測(cè)。與圖3結(jié)果一致，利用基質(zhì)SBA15NA得到的質(zhì)譜圖比使用其它基質(zhì)（CHCA）得到的信號(hào)強(qiáng)度都大數(shù)倍，信噪比都改善很多。由此推測(cè)，新合成的復(fù)合型介孔材料能有效去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾，重現(xiàn)性好，而且有機(jī)基團(tuán)的引入使得4c圖中的氨基酸的質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，具有較寬可測(cè)質(zhì)量范圍，在小分子快速檢測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用空間。3.4其它小分子的分析

上述實(shí)驗(yàn)表明，基質(zhì)SBA15和SBA15NA成功用于糖類和氨基酸類的檢測(cè)，達(dá)到了去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾的效果。為了考察基質(zhì)SBA15NA在其它小分子化合物中的應(yīng)用，本研究選取藥物小分子：普萘洛爾鹽酸鹽（Propranolol hydrochloride）、維拉帕米鹽酸鹽（Verapamil hydrochloride）、阿替洛爾（Atenolol）；植物激素脫落酸（Abscisic acid）、玉米素（Zeatin）作為模型分子進(jìn)行研究，模型分子都可以檢測(cè)到（表1）。從表1可見，與基質(zhì)SBA15相比，基質(zhì)SBA15NA對(duì)于分析物具有更好的離子化作用。因此，MALDITOFMS測(cè)定小分子樣品時(shí)，基質(zhì)的尋找和開發(fā)顯得更為重要。

摘要研究了表面修飾的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合型介孔材料SBA15NA（1，8Naphthalimide）作為基質(zhì)在MALDITOFMS分析中的應(yīng)用。采用1，8萘酰亞胺修飾SBA15，1，8萘二甲酸酐先與3三甲氧基硅基1丙胺反應(yīng)，得到的產(chǎn)物再修飾到SBA15，得到SBA15NA，應(yīng)用修飾后的介孔材料SBA15NA為基質(zhì)獲得了具有背景離子干擾少、離子化效率高、更高的峰值強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)的譜圖。甲醇作為溶劑，分析物和基質(zhì)的濃度比例為1∶10，采用以樣品和基質(zhì)等體積混合均勻點(diǎn)樣方法，對(duì)低糖類、氨基酸類、植物激素生物代謝物和藥物等不同結(jié)構(gòu)的小分子化合物（分子量小于500）進(jìn)行了MALDITOFMS分析。在此優(yōu)化的條件下得到了低檢出限1×10

1引言

代謝物組學(xué)是在生命科學(xué)研究中發(fā)展起來(lái)的一種新興技術(shù)，它重點(diǎn)研究生物體系的內(nèi)源性和外源性代謝物濃度及其動(dòng)態(tài)變化，主要研究對(duì)象是分子量小于1000的小分子化合物。目前，常用的主要研究手段是NMR＼[1＼]， GCMS＼[2＼]， LCNMR＼[3＼]， LCNMRMS＼[4＼]和數(shù)據(jù)處理等技術(shù)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的質(zhì)譜離子化新技術(shù)。該技術(shù)成功解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性的生物大分子難以電離問(wèn)題＼[5，6＼]，因此廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域。然而，由于基質(zhì)自身產(chǎn)生的離子嚴(yán)重干擾小分子目標(biāo)物在低分子量區(qū)域（<400 Da）的分析，所以該技術(shù)不能廣泛用于低分子量化合物的分析。為了克服這些問(wèn)題，人們?cè)诨|(zhì)的選擇和改進(jìn)方面進(jìn)行了大量研究。1988年，Tanaka等[6]首次將納米材料作為基質(zhì)引入到MALDITOFMS 分析中成功應(yīng)用30 nm無(wú)機(jī)鈷納米顆粒和甘油混合分析了蛋白質(zhì)溶菌酶。隨后，以多孔硅＼[7＼]、碳納米管＼[8＼]、硅納米粒子＼[9＼]、金納米粒子＼[10＼]等作為基質(zhì)，廣泛應(yīng)用在MALDITOFMS分析技術(shù)中。多種修飾的多孔硅粉和硅膠顆粒用于MALDITOFMS分析小分子化合物＼[11～14＼]。Li等＼[15＼]成功將喹啉修飾到介孔材料SBA15上，將其作為MALDITOFMS的基質(zhì)應(yīng)用到分析低分子量的糖類化合物和天然蜂蜜中。

本研究以1，8萘二甲酰亞胺固定化介孔材料，應(yīng)用表面修飾的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合型介孔材料SBA15NA作為輔助基質(zhì)，進(jìn)行了低糖、氨基酸以及藥物小分子化合物的MALDITOFMS分析。與常用的有機(jī)基質(zhì)（如DHB，CHCA）比較，介孔材料能夠有效克服使用有機(jī)基質(zhì)分析樣品時(shí)帶來(lái)的基質(zhì)信號(hào)干擾問(wèn)題，可以成功實(shí)現(xiàn)小分子化合物的高通量快速分析。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑

SBA15介孔材料（趙東元院士先進(jìn)材料實(shí)驗(yàn)室提供）； 1，8萘二甲酸酐和3三甲氧基硅基1丙胺（北京Aldrich公司）。2，5二羥基苯甲酸（DHB）、α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、肌紅蛋白、糖類、植物激素、藥物、胞嘧啶、肌肽和5氮胞苷（Sigma公司）。氨基酸生化標(biāo)準(zhǔn)試劑（上海康達(dá)氨基酸廠）。所有溶劑均為色譜純（Sigma公司）； 超純水由Millipore純水系統(tǒng)制備。尿樣采自志愿者，采集后于

Symbolm@@ 80 ℃保存。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

介孔材料的修飾：在干燥的50 mL兩口瓶中加入100 mg， 0.5 mmol/L 1，8萘二甲酸酐， 20 mL無(wú)水乙醇，升溫至回流，待酸酐全部溶解后，攪拌下滴加等當(dāng)量的3三甲氧基硅基1丙胺，N2保護(hù)下回流反應(yīng)3 h，TLC追蹤反應(yīng)進(jìn)展。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至100 mL單口瓶中，減壓除去無(wú)水乙醇，得微黃色固體M1。向100 mL單口瓶中加入30 mL精制甲苯，待固體全部溶解后，再向其中加入1 g有序硅介孔材料SBA15，N2保護(hù)下回流反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，減壓抽濾，濾餅用甲苯、四氫呋喃、丙酮、氯仿進(jìn)行多次洗滌，除去未反應(yīng)物，所得濾餅在N2保護(hù)下干燥，得微黃色固體SBA15NA，見圖解1。

[TS（][HT5”SS]圖解1SBA15NA 合成路線

分析條件：MALDITOFMS：采用了AXIMACFRTM plus基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)量分析系統(tǒng)（日本島津公司），采用N2激光源，發(fā)射波長(zhǎng)為337 nm。正離子反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍為m/z 50～2000 Da， 每張質(zhì)譜圖由總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為50的質(zhì)譜圖平均累計(jì)產(chǎn)生。在數(shù)據(jù)采集前，用馬心肌肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物，校正儀器的絕對(duì)準(zhǔn)確度至0.1 Da。樣品與基質(zhì)溶液采用混合點(diǎn)樣方法（1 μL點(diǎn)樣）。PRESTIGE21紅外光譜儀（KBr壓片法）， UV2550分光光度計(jì)（島津公司）。

3結(jié)果與討論

3.1介孔材料的修飾

Symbolm@@ 1與羰基相連的CN伸縮振動(dòng)）附近也有吸收， SBA15則沒有這些吸收，表明1，8萘酰亞胺成功接到SBA15上。另外，紫外光譜（圖1B）， SBA15NA在350 nm（1，8 萘酰亞胺的特征吸收）附近有吸收帶， SBA15 則沒有，表明1，8萘酰亞胺成功接到SBA15上。SBA15NA的吸收與傳統(tǒng)的基質(zhì)CHCA吸收在相似位置，這是本合成方法的一個(gè)重要方面，因?yàn)樗剐碌幕|(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的MALDITOF質(zhì)譜儀的激光光源有很強(qiáng)的吸收。3.2低糖分析

MALDITOFMS在糖類的分析中具有良好的應(yīng)用前景＼[15＼]。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)基質(zhì)DHB和新型介孔材料分別作為基質(zhì)進(jìn)行了MALDITOFMS分析。從圖2可見，3種糖類的堿金屬離子加合離子峰在不同基質(zhì)下都可檢測(cè)到，它們分別是D葡萄糖（m/z 203＼[M+Na＼]+、219＼[M+K＼]+），D蔗糖（m/z 365＼[M+Na＼]+， 381＼[M+K＼]+），D木糖（m/z 173＼[M+Na＼]+， 189＼[M+K＼]+）。圖2a出現(xiàn)了DHB的一些明顯的基質(zhì)干擾峰（m/z 177＼[M+Na＼]+， 193 ＼[M+K＼]+），圖2b和2c雜峰少。這說(shuō)明在此基質(zhì)作用下，樣品分子及基質(zhì)分子相當(dāng)穩(wěn)定，在離子化過(guò)程中幾乎不發(fā)生碎裂。這是因?yàn)楫?dāng)1，8萘酰亞胺官能團(tuán)修飾到SBA15的表面后，不易汽化到氣相中變成離子，從而能有效去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾。與圖2b相比，圖2c中3種糖類質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是由于修飾到介孔二氧化硅材料上的1，8萘酰亞胺能夠吸收激光照射，所以SBA15NA比SBA15有更強(qiáng)的光吸收，而且可與樣品溶液充分混勻，所以它更容易促進(jìn)分析物的解吸/電離。

3.3氨基酸的分析

氨基酸的分子量一般小于300 Da，傳統(tǒng)基質(zhì)本身在此分子量區(qū)域產(chǎn)生大量的基質(zhì)干擾使得氨基酸的MALDITOFMS分析變得復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)分別以有機(jī)基質(zhì)CHCA和新型介孔材料分別為基質(zhì)，進(jìn)行氨基酸分析。從氨基酸在不同基質(zhì)下的MALDITOFMS分析結(jié)果（圖3）可知，兩種氨基酸都能檢測(cè)到，它們分別是纈氨酸（Val）

氨基酸在小分子量區(qū)域的檢測(cè)。與圖3結(jié)果一致，利用基質(zhì)SBA15NA得到的質(zhì)譜圖比使用其它基質(zhì)（CHCA）得到的信號(hào)強(qiáng)度都大數(shù)倍，信噪比都改善很多。由此推測(cè)，新合成的復(fù)合型介孔材料能有效去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾，重現(xiàn)性好，而且有機(jī)基團(tuán)的引入使得4c圖中的氨基酸的質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，具有較寬可測(cè)質(zhì)量范圍，在小分子快速檢測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用空間。3.4其它小分子的分析

上述實(shí)驗(yàn)表明，基質(zhì)SBA15和SBA15NA成功用于糖類和氨基酸類的檢測(cè)，達(dá)到了去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾的效果。為了考察基質(zhì)SBA15NA在其它小分子化合物中的應(yīng)用，本研究選取藥物小分子：普萘洛爾鹽酸鹽（Propranolol hydrochloride）、維拉帕米鹽酸鹽（Verapamil hydrochloride）、阿替洛爾（Atenolol）；植物激素脫落酸（Abscisic acid）、玉米素（Zeatin）作為模型分子進(jìn)行研究，模型分子都可以檢測(cè)到（表1）。從表1可見，與基質(zhì)SBA15相比，基質(zhì)SBA15NA對(duì)于分析物具有更好的離子化作用。因此，MALDITOFMS測(cè)定小分子樣品時(shí)，基質(zhì)的尋找和開發(fā)顯得更為重要。

摘要研究了表面修飾的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合型介孔材料SBA15NA（1，8Naphthalimide）作為基質(zhì)在MALDITOFMS分析中的應(yīng)用。采用1，8萘酰亞胺修飾SBA15，1，8萘二甲酸酐先與3三甲氧基硅基1丙胺反應(yīng)，得到的產(chǎn)物再修飾到SBA15，得到SBA15NA，應(yīng)用修飾后的介孔材料SBA15NA為基質(zhì)獲得了具有背景離子干擾少、離子化效率高、更高的峰值強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)的譜圖。甲醇作為溶劑，分析物和基質(zhì)的濃度比例為1∶10，采用以樣品和基質(zhì)等體積混合均勻點(diǎn)樣方法，對(duì)低糖類、氨基酸類、植物激素生物代謝物和藥物等不同結(jié)構(gòu)的小分子化合物（分子量小于500）進(jìn)行了MALDITOFMS分析。在此優(yōu)化的條件下得到了低檢出限1×10

1引言

代謝物組學(xué)是在生命科學(xué)研究中發(fā)展起來(lái)的一種新興技術(shù)，它重點(diǎn)研究生物體系的內(nèi)源性和外源性代謝物濃度及其動(dòng)態(tài)變化，主要研究對(duì)象是分子量小于1000的小分子化合物。目前，常用的主要研究手段是NMR＼[1＼]， GCMS＼[2＼]， LCNMR＼[3＼]， LCNMRMS＼[4＼]和數(shù)據(jù)處理等技術(shù)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的質(zhì)譜離子化新技術(shù)。該技術(shù)成功解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性的生物大分子難以電離問(wèn)題＼[5，6＼]，因此廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域。然而，由于基質(zhì)自身產(chǎn)生的離子嚴(yán)重干擾小分子目標(biāo)物在低分子量區(qū)域（<400 Da）的分析，所以該技術(shù)不能廣泛用于低分子量化合物的分析。為了克服這些問(wèn)題，人們?cè)诨|(zhì)的選擇和改進(jìn)方面進(jìn)行了大量研究。1988年，Tanaka等[6]首次將納米材料作為基質(zhì)引入到MALDITOFMS 分析中成功應(yīng)用30 nm無(wú)機(jī)鈷納米顆粒和甘油混合分析了蛋白質(zhì)溶菌酶。隨后，以多孔硅＼[7＼]、碳納米管＼[8＼]、硅納米粒子＼[9＼]、金納米粒子＼[10＼]等作為基質(zhì)，廣泛應(yīng)用在MALDITOFMS分析技術(shù)中。多種修飾的多孔硅粉和硅膠顆粒用于MALDITOFMS分析小分子化合物＼[11～14＼]。Li等＼[15＼]成功將喹啉修飾到介孔材料SBA15上，將其作為MALDITOFMS的基質(zhì)應(yīng)用到分析低分子量的糖類化合物和天然蜂蜜中。

本研究以1，8萘二甲酰亞胺固定化介孔材料，應(yīng)用表面修飾的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合型介孔材料SBA15NA作為輔助基質(zhì)，進(jìn)行了低糖、氨基酸以及藥物小分子化合物的MALDITOFMS分析。與常用的有機(jī)基質(zhì)（如DHB，CHCA）比較，介孔材料能夠有效克服使用有機(jī)基質(zhì)分析樣品時(shí)帶來(lái)的基質(zhì)信號(hào)干擾問(wèn)題，可以成功實(shí)現(xiàn)小分子化合物的高通量快速分析。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑

SBA15介孔材料（趙東元院士先進(jìn)材料實(shí)驗(yàn)室提供）； 1，8萘二甲酸酐和3三甲氧基硅基1丙胺（北京Aldrich公司）。2，5二羥基苯甲酸（DHB）、α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、肌紅蛋白、糖類、植物激素、藥物、胞嘧啶、肌肽和5氮胞苷（Sigma公司）。氨基酸生化標(biāo)準(zhǔn)試劑（上海康達(dá)氨基酸廠）。所有溶劑均為色譜純（Sigma公司）； 超純水由Millipore純水系統(tǒng)制備。尿樣采自志愿者，采集后于

Symbolm@@ 80 ℃保存。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

介孔材料的修飾：在干燥的50 mL兩口瓶中加入100 mg， 0.5 mmol/L 1，8萘二甲酸酐， 20 mL無(wú)水乙醇，升溫至回流，待酸酐全部溶解后，攪拌下滴加等當(dāng)量的3三甲氧基硅基1丙胺，N2保護(hù)下回流反應(yīng)3 h，TLC追蹤反應(yīng)進(jìn)展。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至100 mL單口瓶中，減壓除去無(wú)水乙醇，得微黃色固體M1。向100 mL單口瓶中加入30 mL精制甲苯，待固體全部溶解后，再向其中加入1 g有序硅介孔材料SBA15，N2保護(hù)下回流反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，減壓抽濾，濾餅用甲苯、四氫呋喃、丙酮、氯仿進(jìn)行多次洗滌，除去未反應(yīng)物，所得濾餅在N2保護(hù)下干燥，得微黃色固體SBA15NA，見圖解1。

[TS（][HT5”SS]圖解1SBA15NA 合成路線

分析條件：MALDITOFMS：采用了AXIMACFRTM plus基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)量分析系統(tǒng)（日本島津公司），采用N2激光源，發(fā)射波長(zhǎng)為337 nm。正離子反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍為m/z 50～2000 Da， 每張質(zhì)譜圖由總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為50的質(zhì)譜圖平均累計(jì)產(chǎn)生。在數(shù)據(jù)采集前，用馬心肌肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物，校正儀器的絕對(duì)準(zhǔn)確度至0.1 Da。樣品與基質(zhì)溶液采用混合點(diǎn)樣方法（1 μL點(diǎn)樣）。PRESTIGE21紅外光譜儀（KBr壓片法）， UV2550分光光度計(jì)（島津公司）。

3結(jié)果與討論

3.1介孔材料的修飾

Symbolm@@ 1與羰基相連的CN伸縮振動(dòng)）附近也有吸收， SBA15則沒有這些吸收，表明1，8萘酰亞胺成功接到SBA15上。另外，紫外光譜（圖1B）， SBA15NA在350 nm（1，8 萘酰亞胺的特征吸收）附近有吸收帶， SBA15 則沒有，表明1，8萘酰亞胺成功接到SBA15上。SBA15NA的吸收與傳統(tǒng)的基質(zhì)CHCA吸收在相似位置，這是本合成方法的一個(gè)重要方面，因?yàn)樗剐碌幕|(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的MALDITOF質(zhì)譜儀的激光光源有很強(qiáng)的吸收。3.2低糖分析

MALDITOFMS在糖類的分析中具有良好的應(yīng)用前景＼[15＼]。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)基質(zhì)DHB和新型介孔材料分別作為基質(zhì)進(jìn)行了MALDITOFMS分析。從圖2可見，3種糖類的堿金屬離子加合離子峰在不同基質(zhì)下都可檢測(cè)到，它們分別是D葡萄糖（m/z 203＼[M+Na＼]+、219＼[M+K＼]+），D蔗糖（m/z 365＼[M+Na＼]+， 381＼[M+K＼]+），D木糖（m/z 173＼[M+Na＼]+， 189＼[M+K＼]+）。圖2a出現(xiàn)了DHB的一些明顯的基質(zhì)干擾峰（m/z 177＼[M+Na＼]+， 193 ＼[M+K＼]+），圖2b和2c雜峰少。這說(shuō)明在此基質(zhì)作用下，樣品分子及基質(zhì)分子相當(dāng)穩(wěn)定，在離子化過(guò)程中幾乎不發(fā)生碎裂。這是因?yàn)楫?dāng)1，8萘酰亞胺官能團(tuán)修飾到SBA15的表面后，不易汽化到氣相中變成離子，從而能有效去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾。與圖2b相比，圖2c中3種糖類質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是由于修飾到介孔二氧化硅材料上的1，8萘酰亞胺能夠吸收激光照射，所以SBA15NA比SBA15有更強(qiáng)的光吸收，而且可與樣品溶液充分混勻，所以它更容易促進(jìn)分析物的解吸/電離。

3.3氨基酸的分析

氨基酸的分子量一般小于300 Da，傳統(tǒng)基質(zhì)本身在此分子量區(qū)域產(chǎn)生大量的基質(zhì)干擾使得氨基酸的MALDITOFMS分析變得復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)分別以有機(jī)基質(zhì)CHCA和新型介孔材料分別為基質(zhì)，進(jìn)行氨基酸分析。從氨基酸在不同基質(zhì)下的MALDITOFMS分析結(jié)果（圖3）可知，兩種氨基酸都能檢測(cè)到，它們分別是纈氨酸（Val）

氨基酸在小分子量區(qū)域的檢測(cè)。與圖3結(jié)果一致，利用基質(zhì)SBA15NA得到的質(zhì)譜圖比使用其它基質(zhì)（CHCA）得到的信號(hào)強(qiáng)度都大數(shù)倍，信噪比都改善很多。由此推測(cè)，新合成的復(fù)合型介孔材料能有效去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾，重現(xiàn)性好，而且有機(jī)基團(tuán)的引入使得4c圖中的氨基酸的質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，具有較寬可測(cè)質(zhì)量范圍，在小分子快速檢測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用空間。3.4其它小分子的分析

上述實(shí)驗(yàn)表明，基質(zhì)SBA15和SBA15NA成功用于糖類和氨基酸類的檢測(cè)，達(dá)到了去除基質(zhì)在低分子量區(qū)域的干擾的效果。為了考察基質(zhì)SBA15NA在其它小分子化合物中的應(yīng)用，本研究選取藥物小分子：普萘洛爾鹽酸鹽（Propranolol hydrochloride）、維拉帕米鹽酸鹽（Verapamil hydrochloride）、阿替洛爾（Atenolol）；植物激素脫落酸（Abscisic acid）、玉米素（Zeatin）作為模型分子進(jìn)行研究，模型分子都可以檢測(cè)到（表1）。從表1可見，與基質(zhì)SBA15相比，基質(zhì)SBA15NA對(duì)于分析物具有更好的離子化作用。因此，MALDITOFMS測(cè)定小分子樣品時(shí)，基質(zhì)的尋找和開發(fā)顯得更為重要。