蔬菜水果中赤霉素殘留量HPLC檢測(cè)方法的研究

萬凱+丁晨紅+鄧義才+駱沖+梁應(yīng)坤

摘 要 對(duì)蔬菜水果樣品中的赤霉素殘留量采用高效液相色譜方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：樣品中赤霉素經(jīng)80%甲醇溶液提取，用石油醚脫色，經(jīng)過乙酸乙酯液液萃取和磷酸緩沖液反萃取，再用乙酸乙酯萃取凈化，然后采用C18色譜柱分離，以甲醇和0.1%的冰乙酸水溶液為流動(dòng)相洗脫，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器206 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。在此優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.25～50 mg/L呈良好線性，r=0.999 9，檢出限為0.067 mg/kg。6種蔬菜水果的添加回收率為71.6%～105.2%，RSD為2.1%～9.8%。

關(guān)鍵詞 赤霉素 ；高效液相色譜法 ；蔬菜 ；水果 ；殘留

分類號(hào) O657.7+2

Determination of Gibberellin Residue in Vegetables and Fruits by High Performance Liquid Chromatography

WAN Kai1，2） DING Chenhong1） DENG Yicai2） LUO Chong3） LIANG Yingkun1）

（1 Public Monitoting Center for Agro-product of Guangdong academy of agricultural science， guangzhou， Guangdong 510640；

2 Ministry of Agriculture Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-product（Guangzhou）， guangzhou， Guangdong 510640；

3 Centre for Quality Safety and Standard Research of Agricultural Products，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract Researched the analytical method for the determination of gibberellin acid residue in vegetables and fruit by high-performance liquid chromatography. The GA3 ， after being extrated by using 80% methoanol water solution，decolored by petroleum ether， extracted by ethyl acetace， and then， purged by reversed extraction with Phosphate Buffer（PB） and extrated with ethyl acetate again， was separated on C18 column using methonl and 0.1% acetic acid solution as mobile phases and 206 nm as HPLC detected wavelength. The samples were qualitatived by retention time and quantified with the external calibration method. The results showed the method performed well within the linear range between 0.25 mg/L and 50 mg/L （r=0.999 9）， and the limit of detection was 0.067 mg/kg. The method was used to detect the contents of GA3 in 6 kinds of vegetables and fruit， the recoveries for the spiked samples were ranged from 71.6% to 105.2%， and the variation coefficients were from 2.1% to 9.8%.

Keywords gibberellic acid （GA3） ； high performance liquid chromatography （HPLC） ； vegetable ； fruit ； residue

近年植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑應(yīng)用日益廣泛，主要用作調(diào)節(jié)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)[1]。然而，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也有一定的毒性，如赤霉素（gibberellic acid， GA）可能干擾人體正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，長(zhǎng)期食用可能會(huì)造成器官慢性中毒[2]；Erin等研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素與腫瘤形成有一定關(guān)系[3]。赤霉素參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的多種生理過程，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中[4]。由于一些種植者盲目追求高產(chǎn)及利潤(rùn)，亂用濫用赤霉素，使得蔬菜水果中殘留大量赤霉素，進(jìn)而使農(nóng)產(chǎn)品安全存在潛在危害[5]。

目前，關(guān)于赤霉素殘留量測(cè)定方法主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[6]、熒光法[7-8]、紫外分光光度法[9]、氣相色譜法（GC）[10-11]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）[12]、高效液相色譜法（HPLC）[5，12-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[1，18-20]等。這些方法中有的前處理方法太過繁瑣，有的靈敏度低，有的對(duì)儀器設(shè)備要求很高。HPLC是赤霉素檢測(cè)的有效手段，但目前文獻(xiàn)中的方法操作繁瑣、凈化效果以及靈敏度不能普遍適用于蔬菜水果中赤霉素殘留量的檢測(cè)要求。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蔬菜水果中赤霉素殘留量的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，優(yōu)化樣品前處理方法和檢測(cè)條件。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

島津LC-20A高效液相色譜儀（配可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；旋渦混合器；高速勻漿機(jī)；甲醇（色譜純）；冰乙酸（色譜純）；乙酸乙酯（分析純）；石油醚（分析純）；鹽酸水溶液：1 mol/L的鹽酸溶液；pH 6.2的磷酸鹽緩沖液：1 000 mL蒸餾水中溶解6.7 g磷酸二氫鉀和1.2 g氫氧化鈉。赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品（安譜）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精確稱取赤霉素（含量≥99.0%）0.1 g（精確到0.000 1 g），用甲醇溶解并定容至100 mL。此溶液濃度為每毫升相當(dāng)于1.00 mg赤霉素。

1.2.2 樣品處理方法的選擇

1.2.2.1 提取溶劑

以甲醇和丙酮為提取劑，添加2.0 mg/kg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定回收率。

1.2.2.2 提取方法

以油麥菜為樣品，采用高速勻漿2 min、超聲波振蕩15 min以及振蕩30 min 3種提取方法進(jìn)行效率比較。

1.2.2.3 凈化條件

以番茄和油麥菜為樣品，添加5.0 mg/kg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較液液萃取結(jié)合C18 柱固相萃取和液液萃取結(jié)合反萃取2種凈化方法的回收率。

1.2.3 色譜條件的選擇

1.2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)赤霉素在200～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)有較強(qiáng)的紫外吸收，通過紫外掃描確定最大的吸收峰，以此確定赤霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.3.2 流動(dòng)相

比較甲醇濃度分別為45%、60%、80%時(shí)，赤霉素的色譜峰分離效果。

1.2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限、精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證

將赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 mg/L 8個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化好的儀器條件下上機(jī)對(duì)其測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）回歸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同一實(shí)驗(yàn)室由同一操作者使用相同的前處理方法和設(shè)備，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)赤霉素含量進(jìn)行5次測(cè)定。

選擇3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室對(duì)添加5.0 mg/kg赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的普通白菜樣品進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定。

測(cè)定油麥菜、番茄、普通白菜、辣椒、香蕉和葡萄6種樣品中添加赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.20、2.0、5.0、10.0 mg/kg）的回收率，以空白樣品和加標(biāo)樣品的回收率為對(duì)照。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的確定

2.1.1 提取溶劑

甲醇為提取劑時(shí)回收率為85.3%～92.1%，丙酮為提取劑時(shí)回收率為82.7%～107.3%。二者回收率接近，但甲醇價(jià)格低廉，毒性相對(duì)較低，因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為赤霉素的提取溶劑。

2.1.2 提取方法

高速勻漿、超聲波振蕩和振蕩30 min提取的回收率分別為91.3%、86.4%和114.7%，都符合要求，但超聲波震蕩以及振蕩提取所需時(shí)間長(zhǎng)，且要求提取瓶密封性好，工作效率不高，故本實(shí)驗(yàn)采用高速勻漿法提取。

2.2 凈化條件的選擇

液液萃取結(jié)合C18柱固相萃取凈化回收率為71.6%～89.5%，而液液萃取結(jié)合反萃取的回收率凈化回收率為84.5%～96.1%。液液萃取結(jié)合反萃取凈化效果好，目標(biāo)峰附近干擾明顯減少，因此本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取結(jié)合反萃取凈化。為更好的除去干擾，凈化前采用石油醚除去樣品中的色素。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

赤霉素在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有較強(qiáng)的紫外吸收，通過紫外掃描可知赤霉素206 nm有最大吸收峰，因此本實(shí)驗(yàn)采用206 nm作為赤霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 色譜柱

赤霉素是一種二萜類酸，屬于中等極性的分子，因而固定相宜選擇極性較小的鍵合固定相，流動(dòng)相宜選擇極性較強(qiáng)的溶劑。因此，本實(shí)驗(yàn)采用C18柱進(jìn)行色譜分析。

2.3.3 流動(dòng)相

赤霉素本身性質(zhì)決定了其在溫度低的酸性條件下比較穩(wěn)定。赤霉素溶液在pH 3～4時(shí)最穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇+0.1%冰乙酸水溶液為流動(dòng)相。試驗(yàn)結(jié)果表明，45%的甲醇作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的峰型較好，出峰時(shí)間較合適，且能與附近雜質(zhì)分離開來。因此，采用甲醇+0.1%冰乙酸水溶液作為流動(dòng)相，流動(dòng)相配比為45+55。

2.4 液相色譜分析

圖1為赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖，圖2為油麥菜加標(biāo)樣品的高效液相色譜圖。由圖1～2可知，使用上述條件下進(jìn)行樣品分析，目標(biāo)峰與樣品中雜質(zhì)峰基本達(dá)到基線分離，能夠滿足赤霉素的定性和定量要求。

2.5 方法的線性關(guān)系、檢出限、精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性

赤霉素的線性關(guān)系y=4E-05x+0.278 5，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9，線性關(guān)系良好。赤霉素的最低檢出濃度為0.067 mg/kg。由表1可知，本方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%。由表2可知，本方法的RSD值均<10%，重復(fù)性能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的要求。由表3可知，回收率為71.6%～105.2%，RSD為2.1%～9.8%，變異系數(shù)均<10%，說明分析測(cè)試過程中無明顯的系統(tǒng)誤差，證明赤霉素的樣品分析結(jié)果可靠。

2.6 建立的測(cè)定方法

2.6.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取20 g試樣到250 mL三角瓶中，加入60 mL 80%的甲醇溶液，勻漿提取2 min，布氏漏斗抽濾，提取液轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，用20 mL甲醇溶液重復(fù)潤(rùn)洗濾渣2次，合并提取液；向提取液中加入20 mL石油醚，混勻、靜止，去掉石油醚層。將脫色后的提取液在40℃下減壓濃縮至約20 mL，加鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 2.5～2.8后，加入20 mL乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮至約20 mL，使用等量磷酸鹽緩沖溶液反萃取3次，合并磷酸鹽緩沖液，加鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 2.5～2.8，再加入20 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，40℃下減壓蒸干。加入2 mL甲醇溶解殘?jiān)?，過0.22 μm有機(jī)濾膜，裝瓶供液相色譜分析。endprint

2.6.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm ；流動(dòng)相：甲醇+0.1%冰乙酸水溶液（45+55）；流速：1.00 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm。

3 討論與結(jié)論

目前常用的農(nóng)藥殘留提取溶劑有石油醚、乙酸乙酯﹑丙酮﹑乙腈。由于赤霉素易溶于醇類、丙酮﹑乙酸乙酯等有機(jī)溶劑和pH 6.2的磷酸緩沖液中。微溶于水﹑醚中，不溶于石油醚﹑苯﹑氯仿等溶劑中。赤霉素溶液呈酸性，低pH條件有利于萃取分離。在較強(qiáng)酸度下，赤霉素以穩(wěn)定分子形式存在，提取率主要取決于其在醇中的溶解性能。pH增高，赤霉素存在狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致溶解性能變化。赤霉素常用的提取試劑有甲醇、乙酸乙酯和丙酮。鑒于乙酸乙酯雖然對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥提取效率高，但其同時(shí)提取出大量油脂和色素，給凈化和儀器測(cè)定都增加了難度。本試驗(yàn)分析甲醇和丙酮作為提取試劑，結(jié)果表明甲醇作為提取試劑。

赤霉素殘留檢測(cè)的凈化方法主要有液液萃取、固相萃取以及液液萃取結(jié)合固相萃取。其中液液萃取又分為一步萃取和液液萃取結(jié)合反萃取2種。目前使用HPLC-MS/MS法測(cè)定赤霉素殘留量多采用一步液液萃取或固相萃取凈化，而HPLC法多使用液液萃取結(jié)合固相萃??；相對(duì)于HPLC-MS/MS而言，HPLC對(duì)凈化的要求稍高，一步液液萃取以及固相萃取都不能很好的除去雜質(zhì)干擾；而液液萃取結(jié)合固相萃取的凈化方法操作繁瑣、檢測(cè)成本高。本研究對(duì)比了液液萃取結(jié)合C18固相萃取和液液萃取結(jié)合反萃取的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液液固相萃取結(jié)合反萃取操作更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)。

另外，有文獻(xiàn)中使用206﹑210、220、254、278 nm等波長(zhǎng)作為赤霉素檢測(cè)波長(zhǎng)[5，12，15-17]。通過紫外掃描可知赤霉素在206 nm處有最大吸收峰，在220和278 nm處有較小的吸收峰。在254和278 nm處雜質(zhì)干擾少，但是吸收峰小不能很好的滿足低濃度檢測(cè)需求；而206 nm處響應(yīng)值明顯高于254和278 nm，雖然干擾物質(zhì)相對(duì)較多，但可通過前處理的凈化去除干擾。因此，本試驗(yàn)采用206 nm作為赤霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了HPLC測(cè)定蔬菜水果中赤霉素殘留量的方法。樣品中赤霉素經(jīng)80%甲醇溶液提取后，用石油醚脫色，經(jīng)過液液萃取和反萃取凈化，采用C18色譜柱分離，以甲醇+0.1%的冰乙酸水溶液為流動(dòng)相洗脫，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器在206 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。本研究建立的方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單無需衍生、對(duì)儀器設(shè)備要求不高，易于推廣使用，能滿足日常檢測(cè)需要。

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2.6.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm ；流動(dòng)相：甲醇+0.1%冰乙酸水溶液（45+55）；流速：1.00 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm。

3 討論與結(jié)論

目前常用的農(nóng)藥殘留提取溶劑有石油醚、乙酸乙酯﹑丙酮﹑乙腈。由于赤霉素易溶于醇類、丙酮﹑乙酸乙酯等有機(jī)溶劑和pH 6.2的磷酸緩沖液中。微溶于水﹑醚中，不溶于石油醚﹑苯﹑氯仿等溶劑中。赤霉素溶液呈酸性，低pH條件有利于萃取分離。在較強(qiáng)酸度下，赤霉素以穩(wěn)定分子形式存在，提取率主要取決于其在醇中的溶解性能。pH增高，赤霉素存在狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致溶解性能變化。赤霉素常用的提取試劑有甲醇、乙酸乙酯和丙酮。鑒于乙酸乙酯雖然對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥提取效率高，但其同時(shí)提取出大量油脂和色素，給凈化和儀器測(cè)定都增加了難度。本試驗(yàn)分析甲醇和丙酮作為提取試劑，結(jié)果表明甲醇作為提取試劑。

赤霉素殘留檢測(cè)的凈化方法主要有液液萃取、固相萃取以及液液萃取結(jié)合固相萃取。其中液液萃取又分為一步萃取和液液萃取結(jié)合反萃取2種。目前使用HPLC-MS/MS法測(cè)定赤霉素殘留量多采用一步液液萃取或固相萃取凈化，而HPLC法多使用液液萃取結(jié)合固相萃?。幌鄬?duì)于HPLC-MS/MS而言，HPLC對(duì)凈化的要求稍高，一步液液萃取以及固相萃取都不能很好的除去雜質(zhì)干擾；而液液萃取結(jié)合固相萃取的凈化方法操作繁瑣、檢測(cè)成本高。本研究對(duì)比了液液萃取結(jié)合C18固相萃取和液液萃取結(jié)合反萃取的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液液固相萃取結(jié)合反萃取操作更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)。

另外，有文獻(xiàn)中使用206﹑210、220、254、278 nm等波長(zhǎng)作為赤霉素檢測(cè)波長(zhǎng)[5，12，15-17]。通過紫外掃描可知赤霉素在206 nm處有最大吸收峰，在220和278 nm處有較小的吸收峰。在254和278 nm處雜質(zhì)干擾少，但是吸收峰小不能很好的滿足低濃度檢測(cè)需求；而206 nm處響應(yīng)值明顯高于254和278 nm，雖然干擾物質(zhì)相對(duì)較多，但可通過前處理的凈化去除干擾。因此，本試驗(yàn)采用206 nm作為赤霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了HPLC測(cè)定蔬菜水果中赤霉素殘留量的方法。樣品中赤霉素經(jīng)80%甲醇溶液提取后，用石油醚脫色，經(jīng)過液液萃取和反萃取凈化，采用C18色譜柱分離，以甲醇+0.1%的冰乙酸水溶液為流動(dòng)相洗脫，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器在206 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。本研究建立的方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單無需衍生、對(duì)儀器設(shè)備要求不高，易于推廣使用，能滿足日常檢測(cè)需要。

參考文獻(xiàn)

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2.6.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm ；流動(dòng)相：甲醇+0.1%冰乙酸水溶液（45+55）；流速：1.00 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm。

3 討論與結(jié)論

目前常用的農(nóng)藥殘留提取溶劑有石油醚、乙酸乙酯﹑丙酮﹑乙腈。由于赤霉素易溶于醇類、丙酮﹑乙酸乙酯等有機(jī)溶劑和pH 6.2的磷酸緩沖液中。微溶于水﹑醚中，不溶于石油醚﹑苯﹑氯仿等溶劑中。赤霉素溶液呈酸性，低pH條件有利于萃取分離。在較強(qiáng)酸度下，赤霉素以穩(wěn)定分子形式存在，提取率主要取決于其在醇中的溶解性能。pH增高，赤霉素存在狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致溶解性能變化。赤霉素常用的提取試劑有甲醇、乙酸乙酯和丙酮。鑒于乙酸乙酯雖然對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥提取效率高，但其同時(shí)提取出大量油脂和色素，給凈化和儀器測(cè)定都增加了難度。本試驗(yàn)分析甲醇和丙酮作為提取試劑，結(jié)果表明甲醇作為提取試劑。

赤霉素殘留檢測(cè)的凈化方法主要有液液萃取、固相萃取以及液液萃取結(jié)合固相萃取。其中液液萃取又分為一步萃取和液液萃取結(jié)合反萃取2種。目前使用HPLC-MS/MS法測(cè)定赤霉素殘留量多采用一步液液萃取或固相萃取凈化，而HPLC法多使用液液萃取結(jié)合固相萃?。幌鄬?duì)于HPLC-MS/MS而言，HPLC對(duì)凈化的要求稍高，一步液液萃取以及固相萃取都不能很好的除去雜質(zhì)干擾；而液液萃取結(jié)合固相萃取的凈化方法操作繁瑣、檢測(cè)成本高。本研究對(duì)比了液液萃取結(jié)合C18固相萃取和液液萃取結(jié)合反萃取的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液液固相萃取結(jié)合反萃取操作更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)。

另外，有文獻(xiàn)中使用206﹑210、220、254、278 nm等波長(zhǎng)作為赤霉素檢測(cè)波長(zhǎng)[5，12，15-17]。通過紫外掃描可知赤霉素在206 nm處有最大吸收峰，在220和278 nm處有較小的吸收峰。在254和278 nm處雜質(zhì)干擾少，但是吸收峰小不能很好的滿足低濃度檢測(cè)需求；而206 nm處響應(yīng)值明顯高于254和278 nm，雖然干擾物質(zhì)相對(duì)較多，但可通過前處理的凈化去除干擾。因此，本試驗(yàn)采用206 nm作為赤霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了HPLC測(cè)定蔬菜水果中赤霉素殘留量的方法。樣品中赤霉素經(jīng)80%甲醇溶液提取后，用石油醚脫色，經(jīng)過液液萃取和反萃取凈化，采用C18色譜柱分離，以甲醇+0.1%的冰乙酸水溶液為流動(dòng)相洗脫，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器在206 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。本研究建立的方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單無需衍生、對(duì)儀器設(shè)備要求不高，易于推廣使用，能滿足日常檢測(cè)需要。

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