Bcl－6共抑制因子樣蛋白及E鈣黏蛋白在胃癌中的表達及相關(guān)性分析

王金泗，陳曉耕，林孟波

（福建省立醫(yī)院腫瘤外科，福州 350001）

腫瘤生物學研究顯示惡性腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的過程并涉及許多基因修飾，細胞與細胞之間黏附缺失與腫瘤進展和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，該過程涉及包括小窩蛋白（caveolin－1）、E鈣黏蛋白（E－cadherin）和β連環(huán)蛋白（β－catenin）在內(nèi)的許多細胞膜分子和基因［1－4］。E－cadherin主要參與調(diào)節(jié)上皮細胞與細胞之間黏附，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，在胃癌和卵巢癌等許多惡性腫瘤中，E－cadherin表達下調(diào)或缺失是侵襲性腫瘤的重要特征，并與患者不良預后相關(guān)［5］。Bcl－6共抑制因子樣蛋白1（BCL6corepressor－like 1，BCORL1）是近期研究證實的一種轉(zhuǎn)錄共抑制因子，其與組蛋白脫乙?；福℉DAC）活性相關(guān)，BCORL1通過與C－末端結(jié)合蛋白（CtBP）協(xié)同或單獨與E－cadherin啟動子結(jié)合，從而抑制E－cadherin基因轉(zhuǎn)錄［6］。本課題擬通過免疫組織化學染色技術(shù)檢測BCORL1和E－cadhein在胃癌及對應癌旁組織中的表達，分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及兩者表達的相關(guān)性，初步探討B(tài)CORL1及E－cadherin在胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為胃癌治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 58例胃癌及對應癌旁組織來源于2007年1月至2009年10月本院病理科保存的手術(shù)切除標本，其中男49例，女9例，年齡29～78歲，平均（59.6±10.4）歲。中分化管狀腺癌和黏液癌歸為分化型腫瘤，實體低分化腺癌、非實體低分化腺癌及印戒細胞癌歸為未分化癌，組織病理學診斷：分化型腺癌14例，低分化腺癌42例，未分化癌2例。TNM分期參考國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分類（6版）：Ⅰ期9例，Ⅱ期7例，Ⅲ期17例，Ⅳ期25例。浸潤深度分為黏膜、黏膜下、肌層和漿膜下層。所有患者術(shù)前均未行放射、化療及免疫治療，本研究通過本院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色技術(shù)檢測組織中BCORL1及E－cadherin表達 采用標準生物素－鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶（SP）法對4μm石蠟切片進行染色。切片二甲苯脫蠟及梯度乙醇再水化之后，在10mmol／L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中煮沸20min進行抗原修復，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，3%牛血清清蛋白封閉1h之后，將1∶100稀釋的兔抗人BCORL1多克隆抗體（HPA031775，美國Sigma）和兔抗人E－cadherin單克隆抗體（＃3195，美國Cell Signaling）加于標本后，置于濕盒內(nèi)4℃過夜。滴加生物素標記的二抗工作液，37℃溫箱孵育20min。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，孵育30min。滴加DAB顯色，蘇木素輕度復染，鹽酸乙醇脫色，稀氨水反藍，梯度乙醇脫水至透明。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照，統(tǒng)計分析實驗結(jié)果。

1.2.2 免疫組織化學染色評估 所有切片由兩位病理科醫(yī)生獨立進行半定量評分，用染色強度聯(lián)合陽性細胞百分比進行評分，染色強度分為4等級：陰性0分；弱陽性1分；中度2分；強陽性3分；陽性細胞百分比分級如下：陽性細胞小于或等于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51～75%為3分，＞75%為4分。染色強度和陽性細胞百分比評分相乘大于或等于1分則認為BCORL1或E－cadherin陽性表達［7］。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料用s表示，采用χ2檢驗分析，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌及對應癌旁組織中BCORL1和E－cadherin的表達

對收集的58例胃癌及對應癌旁組織進行BCORL1和E－cadherin免疫組織化學染色，陽性染色為棕黃色或棕褐色，BCROL1表達主要定位在胞質(zhì)和胞膜，E－cadherin表達主要定位于胞膜，見圖1。BCORL1和E－cadherin在胃癌組織中的陽性表達率分別為60.3%（35／58）和27.6%（16／58），而在對應癌旁組織BCORL1和E－cadherin的陽性表達率分別為17.2%（10／58）和63.8%（37／58），兩 組 差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義 （χ2＝22.692，P＝0.000；χ2＝15.321，P＝0.000）。

圖1 BCORL1和E－cadherin在胃癌及癌旁組織中的表達（SP×400）

2.2 BCORL1和E－cadherin表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

BCORL1及E－cadherin表達與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。BCORL1和E－cadherin表達與腫瘤組織病理分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡和腫瘤大小無關(guān)。

表1 BCORL1和E－cadherin表達水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 胃癌組織中BCORL1與E－cadherin表達的相關(guān)性 應用免疫組織化學染色評分半定量BCORL1和E－cadherin表達，Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示在胃癌組織中的BCORL1與 E－cadherin表 達 呈 負 相 關(guān) （r＝ －0.571，P＝0.002）。

3 討 論

BCORL1基因定位于X染色體，是一個轉(zhuǎn)錄共抑制因子，功能研究發(fā)現(xiàn)其可以與Ⅱ類組蛋白脫乙酰基酶（HDAC4、HDAC5和HDAC7）結(jié)合，與CTBP1共抑制因子相互作用抑制E－cadherin表達［8－10］。在多數(shù)正常組織中 BCORL1低表達，而在睪丸和前列腺組織中高表達，有研究通過測序分析肝細胞癌的特征，發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中BCORL1與EFL1形成融合基因，其mRNA表達水平比正常癌旁組織高出6倍多，提示BCORL1是一個腫瘤相關(guān)基因［11］。但是在6%的急性髓性白血病（AML）患者以及21%的AML細胞系中的存在BCORL1基因突變，提示BCORL1是一個新的候選腫瘤促進基因［9］。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中BCORL1蛋白陽性表達率顯著高于對應癌旁組織，其在未分化、浸潤較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期腫瘤中陽性表達率顯著升高，提示BCORL1可能作為癌基因發(fā)揮相應功能。E－cadherin低表達或缺失與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，功能學研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)E－cadherin可減弱細胞與細胞黏附能力，導致腫瘤細胞更容易浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)E－cadherin在胃癌組織中的陽性表達率顯著低于對應癌旁組織，其在未分化、浸潤較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期腫瘤中陽性表達率顯著降低，提示E－cadherin表達減少促進胃癌進展。

從基因表達到運輸以及細胞表面蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，E－cadherin的表達在多個水平被調(diào)控，許多轉(zhuǎn)錄抑制因子被報道能與E－cadherin啟動子區(qū)域的E－box序列結(jié)合誘導其表達下調(diào)，如鋅指蛋白Snail／Slug超家族以及 ZEB1和 ZEB2［12－13］。另外一個導致E－cadherin沉默的相關(guān)機制是啟動子超甲基化［14］。在胃癌形成中E－cadherin是一個標準的腫瘤抑制基因，與散在和遺傳類型胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而E－cadherin遺傳種系突變是導致遺傳性彌漫型胃癌的重要原因［15］。本研究分析了BCORL1及E－cadherin在胃癌組織中表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BCORL1與E－cadherin蛋白表達顯著負相關(guān)，提示BCORL1在胃癌中可能也通過轉(zhuǎn)錄抑制E－cadherin表達，從而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。目前BCORL1在惡性腫瘤中的研究相對較少，本研究通過檢測其在胃癌及癌旁組織中的表達以及其與經(jīng)典抑癌基因E－cadherin的相關(guān)性，初步推測其在胃癌中可能是一個癌基因，通過轉(zhuǎn)錄抑制E－cadherin發(fā)揮促癌功能，但具體的功能及精確的分子機制有待進一步研究。

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