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      硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸和乳酸濃度的影響

      2014-09-20 02:18:02王夢(mèng)芝郝志敏喻禮懷王洪榮
      關(guān)鍵詞:硫胺素丙酸精料

      張 軍 王夢(mèng)芝 郝志敏 喻禮懷 王洪榮*

      (1.揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司,揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng),揚(yáng)州 225009;3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

      目前,伴隨著反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高,反芻動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中精料補(bǔ)充飼料的比例也在不斷加大。而眾所周知的是,飼糧中精料比例的增加有可能導(dǎo)致瘤胃快速降解碳水化合物的爆發(fā)式降解,進(jìn)而導(dǎo)致酸中毒等營養(yǎng)代謝病的發(fā)生,而最終將影響動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能[1]。硫胺素(又稱為維生素B1)屬水溶性維生素,是動(dòng)物體內(nèi)能量代謝途徑中重要的輔酶。它以硫胺素焦磷酸輔酶(TPP)的形式參與碳水化合物代謝過程中α-酮酸的氧化脫羧反應(yīng),是動(dòng)物體內(nèi)整個(gè)能量代謝過程和支鏈氨基酸代謝所必需的水溶性維生素[2]。高精料飼糧快速降解碳水化合物含量高,則其代謝中硫胺素的需求也高,這則可能會(huì)導(dǎo)致硫胺素的缺乏。而硫胺素缺乏可能導(dǎo)致中間代謝受阻,進(jìn)而可能引發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis,SARA),飼料和能量利用效率降低。近年來,關(guān)于硫胺素用于反芻動(dòng)物SARA防治方面已有相關(guān)的研究報(bào)道[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究也已表明,奶牛在精粗比為3∶7條件下可以不添加硫胺素,而在6∶4 條件下則需要添加硫胺素[4],但迄今其具體的添加量還沒有明確論斷,為此,本試驗(yàn)在高精料條件下添加硫胺素,測(cè)定其培養(yǎng)液中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)以及乳酸濃度的變化情況,以初步篩選高精料條件下硫胺素合適的添加量,為下一步體內(nèi)試驗(yàn)添加量的確定提供一些參考,同時(shí)也為集約化飼養(yǎng)條件下反芻動(dòng)物SARA的防治提供一些思路。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

      由揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司第一牧場(chǎng)選擇4頭身體健康狀況良好,體重相近,安裝瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)用牛在試驗(yàn)期間飼喂該牧場(chǎng)常用全混合日糧(TMR),每日07:00和19:00分2次等量飼喂,自由飲水,用于采集瘤胃液。

      1.2 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      試驗(yàn)用鹽酸硫胺素的純度≥99%,購自天津福德士科技有限公司。

      試驗(yàn)選用單因子5水平試驗(yàn)設(shè)計(jì),A為對(duì)照組,不添加硫胺素,B、C、D、E組為試驗(yàn)組,分別添加60、120、180和240 mg/kg的鹽酸硫胺素(各試驗(yàn)組硫胺素的有效添加量分別為53.50、107.00、160.50、214.00 mg/kg),每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。底物組成與硫胺素添加量見表1。由于底物采用半純合飼糧配制,由表1中可知,底物精粗比[(小麥淀粉+可溶性淀粉+酪蛋白)∶(木聚糖+果膠+羧甲基纖維素+濾紙纖維素)]為6∶4,粗蛋白質(zhì)含量為17%。由于硫胺素的添加量很少,在培養(yǎng)前先將鹽酸硫胺素溶解在水中,然后按設(shè)計(jì)的劑量換算后添加至培養(yǎng)液中。

      參照 De Oliveira等[5]的方法配制精粗比 6∶4條件下的人工唾液鹽,組成見表2。人工唾液鹽在使用前1天配制,并通入二氧化碳(CO2)待用。

      表1 底物組成與硫胺素的添加量Table 1 Substrate composition and thiamine supplemental level

      表2 人工唾液鹽組成Table 2 Composition of artificial saliva g/L

      1.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

      在奶牛晨飼前,利用自制真空負(fù)壓裝置,4頭瘺管牛分別各采集瘤胃液150 mL,經(jīng)紗布過濾后裝入保溫瓶,并通CO2,置于恒溫水浴中保溫。

      于采樣前3小時(shí)配制好人工唾液鹽,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱取底物原料,各加入之前配制好的人工唾液鹽80 mL,再各加入采集后經(jīng)過濾的瘤胃液40 mL,通過進(jìn)氣通道通入CO2氣體至飽和,并放置于恒溫水浴箱中。另外增設(shè)1個(gè)瘤胃液與人工唾液鹽混合無底物的空白對(duì)照。

      于培養(yǎng)后 0、1、3、6、10、24、48、72 h 取培養(yǎng)液樣,每次取5 mL,于-20℃冷凍保存,用于揮發(fā)性脂肪酸和乳酸濃度的測(cè)定。

      1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

      1.4.1 揮發(fā)性脂肪酸

      培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸濃度使用日本島津GC-9A氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定[6]。

      1.4.2 乳酸

      培養(yǎng)液乳酸濃度的測(cè)定采用對(duì)羥基聯(lián)苯法[7]進(jìn)行。

      1.5 數(shù)據(jù)處理

      用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理;用SPSS 17.0的one way-ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

      2 結(jié)果

      2.1 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵乳酸濃度的影響

      由表3可見,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,各試驗(yàn)組乳酸的濃度整體上呈先上升后下降,再上升而后下降,并趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。而隨著硫胺素添加量的增加,各試驗(yàn)組乳酸濃度基本呈降低的趨勢(shì),但在最高添加量的E組略有升高。

      從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn),0 h時(shí),乳酸濃度在組間沒有顯著的差異(P>0.05);1、3 h時(shí),D組乳酸濃度顯著低于B和C組(P<0.05),極顯著低于A組和E組(P<0.01);6、10 h時(shí),D組顯著低于C和E組(P<0.05),極顯著低于A和B組(P<0.01);24 h時(shí),D組顯著低于A和B組(P<0.05),與C和E組差異不顯著(P>0.05);48、72 h時(shí),各試驗(yàn)組的乳酸濃度均與對(duì)照組乳酸濃度差異不顯著(P>0.05)。

      表3 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵乳酸濃度的影響Table 3 Effects of thiamine on lactate concentration of high concentrate substrate after in vitro rumen fermentation mmol/L

      2.2 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度和比例的影響

      由表4可見,總體上,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,各組乙酸、丙酸、丁酸的濃度皆呈逐漸上升的趨勢(shì);但在72 h時(shí)略有下降。

      從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn),6 h時(shí),D、E組乙酸濃度顯著或極顯著低于A組(P<0.05或P<0.01),而B、C組與A組差異不顯著(P>0.05);其他時(shí)間點(diǎn)各試驗(yàn)組和A組相比差異都不顯著(P>0.05)。6 h時(shí),C、E組丙酸濃度顯著低于A、B、D組(P<0.05);48 h時(shí),D、E組均顯著高于A、B組(P<0.05)。丁酸濃度除6 h時(shí)B、C組顯著或極顯著低于其他各組(P<0.05或P<0.01)外,其他各時(shí)間點(diǎn)各組之間差異均不顯著(P>0.05)。

      由表5可見,培養(yǎng)液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸上升,并在72 h時(shí)略有下降。其中以D組最高,為41.74 mmol/L。

      從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)開始0 h時(shí),TVFA濃度組間的差異不顯著(P>0.05);1 h時(shí),E組顯著高于其他各組(P<0.05);3 h時(shí),B組顯著高于C、D、E組(P<0.05);10 h時(shí),B組顯著高于A和C組(P<0.05);24、48、72 h時(shí),雖然組間的差異不顯著(P>0.05),但數(shù)值上皆以 D組最高。

      表4 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響Table 4 Effects of thiamine on volatile fatty acid concentrations of high concentrate substrate after in vitro rumen fermentation mmol/L

      培養(yǎng)液中乙酸與丙酸比例隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)波動(dòng)變化。其中D組在相對(duì)較低的水平波動(dòng),其平均值為1.55。

      從不同時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)開始0 h時(shí),乙酸與丙酸比例在組間的差異不顯著(P>0.05);1 h時(shí),A組顯著高于 C、D、E組(P<0.05);6 h時(shí),C組顯著高于其他各組(P<0.05);24、48、72 h時(shí),D組皆顯著或極顯著低于A組(P<0.05或 P<0.01)。

      3 討論

      3.1 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵乳酸濃度的影響

      長期以來,人們一直認(rèn)為反芻動(dòng)物瘤胃的微生物能合成充足的硫胺素,并能滿足其營養(yǎng)代謝的需要[8-10]。然而,在集約化的生產(chǎn)中,反芻動(dòng)物在高精料的飼養(yǎng)條件或泌乳期及妊娠期等特殊生理狀況下,也需要在飼糧中添加硫胺素等水溶性維生素。硫胺素以TPP的形式參與碳水化合物代謝過程中α-酮酸的氧化脫羧反應(yīng),一旦機(jī)體缺乏硫胺素,則碳水化合物代謝受阻,就會(huì)導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物乳酸積累及揮發(fā)性脂肪酸比例的失衡而誘發(fā)瘤胃酸中毒或SARA。有研究報(bào)道,奶牛的飼糧從粗飼料突然轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔锨闆r下,瘤胃中微生物群體改變,瘤胃球菌消失,而乳酸利用菌成為了瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群,同時(shí)乳酸的濃度增加[11]。韓昊奇等[12]對(duì)奶山羊的研究也表明,非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(NFC/NDF)升高至1.63時(shí),瘤胃乳酸桿菌及壞死梭形桿菌的數(shù)量顯著增加。

      表5 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵總揮發(fā)性脂肪酸濃度和乙酸與丙酸比例的影響Table 5 Effects of thiamin on total volatile fatty acid concentration and acetate/propionate of high concentrate substrate after in vitro rumen fermentation

      本試驗(yàn)中,在高精料底物培養(yǎng)條件下添加硫胺素,結(jié)果培養(yǎng)液中乳酸的濃度呈降低的趨勢(shì),并以D組添加180 mg/kg的硫胺素效果最好。其原因可能是:添加硫胺素促進(jìn)了瘤胃微生物對(duì)乳酸的吸收利用(在體內(nèi)還有瘤胃上皮細(xì)胞的吸收),或者是促進(jìn)了乳酸的轉(zhuǎn)化而使其積累量減少;也可能是改變了微生物的群體結(jié)構(gòu)而使乳酸的產(chǎn)生量減少。乳酸濃度的降低可緩解酸中毒的發(fā)生而提高生產(chǎn)性能,這與前人研究發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)奶牛飼喂的高精料飼糧中添加硫胺素有助于提高生產(chǎn)性能[3]是一致的。但至于其乳酸濃度降低,具體的機(jī)理,如微生物區(qū)系的變化、乳酸的代謝去路等一系列問題還有待于進(jìn)一步的研究。

      3.2 硫胺素對(duì)高精料底物瘤胃體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

      瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸主要來源于飼糧中碳水化合物的發(fā)酵,其濃度和比例主要受飼糧組成的影響。飼糧中的碳水化合物在動(dòng)物采食后在瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,同時(shí),隨著瘤胃微生物的生長繁殖部分揮發(fā)性脂肪酸被利用,加之瘤胃上皮細(xì)胞吸收揮發(fā)性脂肪酸,以及揮發(fā)性脂肪酸隨食糜向后消化道排出,揮發(fā)性脂肪酸濃度呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。本研究TVFA濃度在培養(yǎng)后逐漸增加,其原因可能是:體外試驗(yàn)與體內(nèi)試驗(yàn)不同,產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸不能夠被瘤胃上皮細(xì)胞吸收和隨食糜排出。但體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液具有一定的緩沖能力,TVFA在一定的范圍內(nèi)并不會(huì)影響微生物的正常發(fā)酵[13];同時(shí),這也能在一定程度上反映微生物的發(fā)酵力。本試驗(yàn)表明,以D組添加180 mg/kg水平硫胺素的TVFA濃度最高,這提示該添加量可改善發(fā)酵環(huán)境和提高微生物的發(fā)酵力。

      揮發(fā)性脂肪酸可以為反芻動(dòng)物提供70%~80%的消化能[14-15],并且通過揮發(fā)性脂肪酸代謝還可為瘤胃消化代謝提供大部分能量[16]。其中乙酸和丙酸均能在反芻動(dòng)物代謝過程中提供能量,且丙酸發(fā)酵產(chǎn)生的能量較多,乙酸與丙酸比例過高會(huì)影響能量的利用效率[17],而不利于高精料催肥。由本試驗(yàn)結(jié)果可看出,乙酸與丙酸比例在培養(yǎng)開始的0~1 h在2.05~2.87變動(dòng),這表明發(fā)酵偏向于乙酸型;而在培養(yǎng)3 h后則下降至1.61~1.75,這表明發(fā)酵偏向于丙酸型。以上可能是由于發(fā)酵之初,瘤胃微生物的發(fā)酵更接近于所采集奶牛瘤胃中的體內(nèi)發(fā)酵,而在高精料的培養(yǎng)底物開始發(fā)酵后,丙酸則迅速增加而導(dǎo)致了乙酸與丙酸比例的下降。在培養(yǎng)3 h后,乙酸與丙酸比例雖然在組間(除10 h測(cè)定時(shí)間點(diǎn)外)有顯著差異,但都在1.16~1.87變動(dòng),這表明高精料底物培養(yǎng)條件下以偏向于丙酸型發(fā)酵??傮w上,還是以D組添加180 mg/kg的硫胺素乙酸與丙酸比例較低,結(jié)合其TVFA濃度最高,認(rèn)為補(bǔ)充硫胺素可以維持高精料底物培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定發(fā)酵。本試驗(yàn)可為目前反芻動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中,規(guī)?;?、集約化、高精料飼養(yǎng)方式下容易引發(fā)的瘤胃SARA的防治提供一種新的解決思路。

      4 結(jié)論

      ①高精料條件下,添加硫胺素整體上降低了培養(yǎng)液乳酸的濃度,并以添加180 mg/kg硫胺素組效果較好,同時(shí)該組還提高了TVFA的濃度,降低了乙酸與丙酸比例。

      ②添加180 mg/kg的硫胺素能夠較好地穩(wěn)定高精料(6∶4)底物的瘤胃發(fā)酵。

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