凝膠滲透色譜-高效液相色譜熒光法測定脂溶性天然色素中特丁基對(duì)苯二酚

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(1.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司,邯鄲 057250；2.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心,邯鄲 057250)

凝膠滲透色譜-高效液相色譜熒光法測定脂溶性天然色素中特丁基對(duì)苯二酚

孫建玲1,2,楊清山1,2,張玉芬1,高偉1,2，*

(1.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司,邯鄲 057250；2.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心,邯鄲 057250)

建立了脂溶性天然色素中特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)的檢測方法。樣品經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)技術(shù)去除色素和脂類,高效液相色譜熒光法進(jìn)行定性、定量分析。加標(biāo)水平為0.5～1.5mg/kg時(shí),TBHQ的回收率為85.50%～103.33%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.06%～7.04%。方法檢出限0.1mg/kg。本方法具有凈化效果好,準(zhǔn)確靈敏,回收率高等優(yōu)點(diǎn),適用于脂溶性天然色素中特丁基對(duì)苯二酚的檢測。

凝膠滲透色譜,高效液相色譜熒光法,特丁基對(duì)苯二酚,脂溶性天然色素

特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)作為一種有效的抗氧化劑,常被添加到油脂和富脂食品中[1-3],但是大量食用TBHQ會(huì)有致畸、致癌的風(fēng)險(xiǎn),所以TBHQ的使用量受到嚴(yán)格限制和嚴(yán)格監(jiān)控。目前,TBHQ檢測主要針對(duì)食用油、工業(yè)用油、富脂食品和食品包裝材料等,尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)脂溶性天然色素如辣椒紅和葉黃素等中TBHQ含量檢測方法的報(bào)道。因此開發(fā)脂溶性天然色素中TBHQ的檢測方法是十分必要的。國內(nèi)外TBHQ的檢測手段主要有氣相色譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]和質(zhì)譜法[8-9],其中氣相色譜法靈敏度較低,易受雜峰干擾；質(zhì)譜法特異性強(qiáng),但成本高使之不能廣泛應(yīng)用。高效液相色譜熒光法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和成本低的優(yōu)點(diǎn),適用于TBHQ的檢測分析。在前處理方面,目前采用的是傳統(tǒng)柱層析法和有機(jī)試劑反復(fù)提取法,操作繁瑣,實(shí)驗(yàn)周期長。本實(shí)驗(yàn)采用的凝膠滲透色譜(GPC)以多孔凝膠為固定相,利用分離物分子量大小不同而達(dá)到分離目的,具有操作簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn),對(duì)于富含脂肪、色素和蛋白質(zhì)等樣品的凈化具有明顯優(yōu)勢[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)采用GPC進(jìn)行樣品前處理,高效液相色譜-熒光法測定脂溶性天然色素中TBHQ的含量,極大提高了檢測靈敏度,具有良好的適用性,為脂溶性天然色素中TBHQ含量的測定提供了一種可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

環(huán)己烷(分析純,重蒸)；乙酸乙酯(分析純,重蒸)；甲醇(色譜純)；乙酸(色譜純)；TBHQ(分析純,99%,CAS.No:1948-33-0)。

高效液相色譜系統(tǒng)Agilent 1260型,配有熒光檢測器 安捷倫科技有限公司；凝膠滲透色譜儀J2 Preplinc 普利泰科儀器)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R201BL 上海申生科技有限公司；萬分之一天平AUY220 島津；超聲波清洗機(jī)TH600 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取100mg TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品,以色譜甲醇溶解并定容至100mL,配制成濃度為1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置4℃冰箱中保存,有效期為7天。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用色譜甲醇稀釋至所需濃度,濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 辣椒紅 稱取混合均勻的辣椒紅1.0000g,用重蒸后的GPC流動(dòng)相(1∶1,V/V)定容至10mL,振蕩或超聲溶解后過0.45μm濾膜至GPC進(jìn)樣管中,待GPC凈化。

1.2.2.2葉黃素油 稱取葉黃素油1.0000g,后按1.2.2.1進(jìn)行。

1.2.2.3 GPC凈化 用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,V/V)作為GPC流動(dòng)相,流速為4.7mL/min,檢測紫外吸收波長為254nm,流動(dòng)相收集時(shí)間25-35min。將收集的濾液旋蒸近干,用1.0 mL色譜甲醇溶解,后過濾膜進(jìn)行液相檢測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mLTBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC檢測,記錄色譜圖；以TBHQ溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X,HPLC測定的TBHQ的響應(yīng)面積為縱坐標(biāo)Y,所得回歸方程,即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度考察 取同批次加標(biāo)水平為1.0mg/kg辣椒紅和葉黃素油樣品,經(jīng)GPC前處理后連續(xù)5次測定進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。根據(jù)樣品結(jié)果計(jì)算本方法的精密度。

1.2.5 重現(xiàn)性考察 取同批次加標(biāo)水平為0.5mg/kg辣椒紅和葉黃素油樣品各5份,凈化處理后作重復(fù)性實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)結(jié)果的重現(xiàn)性。

1.2.6 回收率考察 取辣椒紅和葉黃素油樣品,分別加入TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品至0.5、1.0和1.5mg/kg三個(gè)水平。每濃度平行三樣本,按1.2.2操作后完成樣品制備。在確定的色譜條件下進(jìn)行HPLC測定,計(jì)算日內(nèi)回收率。連續(xù)考察3d,計(jì)算日間回收率。

1.2.7 穩(wěn)定性考察 對(duì)加標(biāo)水平為1.0mg/kg的辣椒紅、葉黃素油樣品連續(xù)5天進(jìn)行TBHQ含量測定,作TBHQ在樣品中的穩(wěn)定性考察。

1.2.8 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm,3.5μm)；流動(dòng)相A為1.0%乙酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,VA∶VB=60%∶40%等度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；最大激發(fā)波長λex為293nm,最大發(fā)射波長λem為332nm。

1.2.9. 分析樣品 在相同液相色譜條件下,對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液進(jìn)行測定,以保留時(shí)間定性,以樣品響應(yīng)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1凈化方式

GPC能有效去除樣品中油脂和色素等大分子的干擾,可用于脂質(zhì)和色素含量較高的基質(zhì)的凈化。本研究采用GPC凈化脂溶性色素樣品。辣椒紅、TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液和加入TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品后的辣椒紅的紫外色譜圖見圖1。結(jié)果表明,脂類和大多數(shù)色素在前25min內(nèi)流出GPC柱(圖1A),TBHQ在25～35min流出(圖1B)。絕大多數(shù)辣椒紅可與TBHQ有效分離,收集25-35min內(nèi)樣品可獲得凈化后的目標(biāo)物(圖1C)。

圖1 辣椒紅和TBHQ GPC圖Fig.1 Gel permeation chromatography of paprika red and TBHQ(20μg/mL)注:A:辣椒紅GPC圖；B:TBHQ(20μg/mL)GPC圖； C:加標(biāo)后辣椒紅GPC圖。

2.2流動(dòng)相的選擇

對(duì)于TBHQ的測定,一般采用乙腈、甲醇和水作為流動(dòng)相在反相C18色譜柱上進(jìn)行色譜分離。本實(shí)驗(yàn)分別以乙腈、甲醇和乙腈-甲醇(1∶1,V/V)為流動(dòng)相進(jìn)行樣品測定發(fā)現(xiàn),乙腈為流動(dòng)相可使相應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)。水相中加入乙酸可優(yōu)化峰形[12-13],防止峰拖尾現(xiàn)象。當(dāng)乙酸濃度低于0.5%時(shí),有色譜峰拖尾現(xiàn)象；乙酸濃度大于5%時(shí),儀器損害較大。實(shí)驗(yàn)表明,采用1%乙酸可獲得理想的峰形。等度流動(dòng)相1%乙酸水-乙腈溶液即可有效分離雜質(zhì)與TBHQ峰,適用于TBHQ的檢測。

表1 檢測精密度結(jié)果Table 1 Precision of method

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility of method

表3 樣品回收率結(jié)果Table 3 Recoveries in paprika red and lutein

2.3穩(wěn)定性考察

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中我們發(fā)現(xiàn),隨著測定天數(shù)的增加,相同濃度的TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)峰面積有下降趨勢。這意味著TBHQ隨時(shí)間延長會(huì)不斷消耗。將TBHQ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與空白辣椒紅和葉黃素油混合均勻,連續(xù)5d進(jìn)行TBHQ含量測定發(fā)現(xiàn),葉黃素油中的TBHQ含量存在明顯降低現(xiàn)象。在辣椒紅中,TBHQ的消耗并不明顯,這與樣品本身的性質(zhì)相關(guān)。葉黃素油中葉黃素晶體成分本身是一種抗氧化劑,較辣椒紅更易被氧化,因此TBHQ在葉黃素油中的抗氧化保護(hù)作用更明顯,損耗較快。為保證檢測準(zhǔn)確性,提取TBHQ后檢測應(yīng)及時(shí)進(jìn)行,并出具穩(wěn)定性檢測數(shù)據(jù)。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系和檢出限 采用1.2.3節(jié)的條件進(jìn)行HPLC分析。在0.05～10.0μg/mL范圍內(nèi)線性方程為Y=61.655X-2.6936,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。根據(jù)3倍信噪比得出方法檢出限為0.1mg/kg。相比高效液相色譜紫外檢測法檢出限0.5～5.0mg/kg[3,14],氣相色譜法檢出限5.0mg/kg[7],本方法檢測TBHQ的靈敏度很高。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)水平為1.0mg/kg的空白辣椒紅和葉黃素油樣品中TBHQ精密度測定結(jié)果見表1。精密度實(shí)驗(yàn)中辣椒紅的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%,葉黃素油的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22%。本方法測定TBHQ具有良好的檢測精密度。

2.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)水平為0.5mg/kg辣椒紅和葉黃素油樣品中TBHQ含量重現(xiàn)性測定結(jié)果見表2。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中辣椒紅的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.06%,葉黃素油的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.53%。因此,本方法檢測TBHQ具有較好的重復(fù)性。

2.4.4 回收率實(shí)驗(yàn) 在選定的色譜條件下,對(duì)未檢出TBHQ的辣椒紅和葉黃素油分別添加TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液至0.5、1.0和1.5mg/kg三個(gè)水平。按所確定的提取、凈化以及檢測條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)?；厥章式Y(jié)果見表3。

由表3可知,辣椒紅中TBHQ的平均回收率在85.50%～97.94%,日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.09%～5.22%,日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.17%～7.04%。葉黃素油中TBHQ的平均回收率在92.37%～103.33%,日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.65%～5.37%,日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%～5.75%。本方法良好的回收率和準(zhǔn)確性。

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)辣椒紅、葉黃素油樣品中TBHQ含量穩(wěn)定性考察結(jié)果見表4。TBHQ在葉黃素油中有明顯損耗,而在辣椒紅樣品中的消耗并不明顯。因此測定TBHQ時(shí),為保證檢測準(zhǔn)確性,應(yīng)提供穩(wěn)定性檢測數(shù)據(jù)。

2.4.6 樣品檢測 利用本方法分別對(duì)3組不同批次的辣椒紅和葉黃素油進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明兩種樣品共6批次在9.354min均未出現(xiàn)目標(biāo)峰(圖2B),因此確定產(chǎn)品辣椒紅和葉黃素油中TBHQ含量低于檢出限。對(duì)辣椒紅色素和葉黃素油樣品進(jìn)行加標(biāo),在9.354min有明確TBHQ峰出現(xiàn)(圖2C),TBHQ目標(biāo)峰與辣椒紅中的雜質(zhì)峰或特征峰得到很好地分離,可完成TBHQ的準(zhǔn)確測定,見圖2。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Stability of TBHQ in paprika red and lutein

圖2 TBHQ色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of TBHQ注:A:TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(含量10μg/mL,保留時(shí)間為 9.354min)；B:辣椒紅中TBHQ測定譜圖； C:加標(biāo)后辣椒紅中TBHQ測定譜圖。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,利用凝膠滲透色譜凈化系統(tǒng)對(duì)脂溶性天然色素進(jìn)行樣品前處理,在保證較高回收率和精密度的前提下可用于測定脂溶性天然色素中TBHQ的含量。確定了色譜條件:色譜柱為Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,3.5μm)；流動(dòng)相A為1.0%乙酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,以A∶B為60∶40比例等度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；最大激發(fā)波長為293nm,最大發(fā)射波長為332nm。結(jié)果顯示TBHQ的線性范圍為0.05～10.0μg/mL(R2=0.9999)精密度小于5%,重復(fù)性和回收率較好。方法具有靈敏度高,操作簡便等優(yōu)點(diǎn),為脂溶性天然色素中TBHQ含量的測定提供了可靠的分析手段。

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Determination of tert-butylhydroquinone in fat-soluble pigments by gel permeation chromatography and high performance liquid chromatography with fluorometric detector

SunJianling1,2,YangQingshan1,2,ZhangYufen1,GAOWei1,2，*

(1.Chenguang Biotech Group Co.,Ltd.,Handan 057250，China;2.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments,Handan 057250,China)

A novel method was developed for the determination of tert-butylhydroquinone(TBHQ)in fat-soluble pigments using gel permeation chromatography(GPC)and high performance liquid chromatography with fluorometric detector. The average recoveries of TBHQ were 85.50%～103.33%,spiked at the level of 0.5～1.5mg/kg. The relative standard deviations were in the range of 1.06%～7.04%,and the procedure allows the detection of 0.1mg/kg. The method was rapid,precise and high efficient. It can be extended to the analysis for TBHQ in fat-soluble pigments.

gel permeation chromatography;high performance liquid chromatography with fluorometric detector;tert-butylhydroquinone;fat-soluble pigments

2013-12-27 *通訊聯(lián)系人

李艷(1982-)，女，博士研究生，助理研究員，研究方向: 生物活性物質(zhì)功效及應(yīng)用。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B010500006);廣東省高等職業(yè)院校珠江學(xué)者崗位計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011)。

TS207.3

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001