不同方法提取國(guó)槐葉黃酮及其抗氧化活性研究

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(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅張掖 734000)

不同方法提取國(guó)槐葉黃酮及其抗氧化活性研究

李小勇1,霍喜東1,楊自勇1,張勇1,2,李彩霞1,2,*

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅張掖 734000)

研究超聲波輔助雙水相、回流、半仿生、水提、超聲波輔助雙水相(堿)性5種提取方法提取國(guó)槐葉黃酮以及抗氧化活性。結(jié)果表明,回流提取黃酮含量大于其它幾種提取方法,與其它3種方法比較黃酮含量差異顯著(p<0.05),而與超聲波輔助雙水相提取比較差異不顯著(p>0.05)?？寡趸Y(jié)果顯示,5種提取方法所得的黃酮提取物均有較強(qiáng)的抗氧化活性,但超聲波輔助雙水相黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用和對(duì)銅離子的還原力優(yōu)于其它方法,超聲波輔助雙水相(堿)性黃酮提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用及對(duì)鐵離子的螯合能力最好。而不同提取物對(duì)亞油酸自氧化的抑制作用的強(qiáng)弱順序是回流>超聲波輔助雙水相>半仿生>超聲輔助雙水相(堿)>水提。由此說(shuō)明,國(guó)槐葉黃酮易溶于有機(jī)溶劑,超聲輔助雙水相提取物具有很好的抗氧化性。

國(guó)槐葉,黃酮,提取方法,抗氧化活性

黃酮類是廣泛存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類化合物,在蔬菜、作物、水果等植物中均有分布[1]。研究表明,黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基,直接抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抗致癌因子、抑制血管生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力[2-3]等多種生理活性,因而對(duì)于該類化合物的研究與開(kāi)發(fā)倍受關(guān)注。

黃酮的提取方法很多,目前較為普遍的提取方法有回流提取、微波、超聲、微波輔助回流[4]、超聲波輔助雙水相等提取方法[5-6]等。由于提取方法不同,黃酮的性質(zhì)存在較大的差異。

國(guó)槐(SophorajaponicaL.)為蝶形花科(Papilionoideae)落葉喬木,是綠化樹(shù)、行道樹(shù)、蜜源樹(shù)的優(yōu)良品種之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)國(guó)槐各組織器官均含有大量的藥用成分[8],目前,許多學(xué)者對(duì)國(guó)槐中活性物質(zhì)進(jìn)行了研究,Paniwnyk L等[9]對(duì)槐米中蘆丁進(jìn)行了提取；龔盛昭[10]等利用微波技術(shù)提取槐米中的蘆?。惶镏忻馵11]等對(duì)槐角中槐角苷的超聲提取工藝進(jìn)行了研究；叢艷波等[12]用亞臨界水提取槐角總異黃酮；而對(duì)于國(guó)槐葉的研究?jī)H見(jiàn)不同生長(zhǎng)期總黃酮的含量測(cè)定[13]及葉中黃酮抗氧化[14]方面的報(bào)道,而未見(jiàn)國(guó)槐葉黃酮提取方法研究方面的報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)以國(guó)槐葉為材料,研究國(guó)槐葉黃酮提取方法及其黃酮提取物清除DPPH、ABTS自由基,抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性、鐵離子螯合能力及銅離子還原力,以期找出適宜、快速、簡(jiǎn)單而抗氧化活性高的提取方法,為國(guó)槐葉活性成分的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

材料采自甘肅省河西學(xué)院校園,經(jīng)張勇教授鑒定為蝶形花科植物國(guó)槐(SophorajaponicaL.)的樹(shù)葉,將葉子洗凈、陰干、粉碎、過(guò)篩(60目)經(jīng)石油醚脫脂后保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁、ABTS(2,2′-朕氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯林-6-磺酸)、DPPH(二苯代苦味肼基)、Neocuproine(新銅試劑)、Ferrozine(菲咯嗪) 均購(gòu)自Sigma公司；甲醇、乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、亞油酸等藥品 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AE200電子分析天平 Mettler Toledo公司；S24分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司；SHZ—2000循環(huán)水式真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BF-26恒溫控制器 杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司；CR21G-II離心機(jī) 日本日立公司；AP-9925無(wú)油真空泵 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2黃酮的提取及含量測(cè)定

1.2.1 國(guó)槐葉黃酮的提取

1.2.1.1 超聲波輔助雙水相體系提取國(guó)槐葉黃酮 超聲波輔助雙水相體系提取國(guó)槐葉黃酮采用文獻(xiàn)[14]。

1.2.1.2 回流提取 稱取2g國(guó)槐葉粉末,按料液比1∶40加入95%乙醇,在溫度80℃、回流1.5h,減壓過(guò)濾,濾液在45℃,0.08Mpa減壓濃縮后置于50mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度,測(cè)定提取液黃酮含量。

1.2.1.3 半仿生提取 半仿生提取參照文獻(xiàn)[15]。稱取2g國(guó)槐葉粉末,按料液比1∶40加入蒸餾水,用HCl調(diào)pH至2,在溫度37℃、超聲提取10min、冷卻后離心,取上清液移至蒸餾燒瓶中。將沉淀加40mL蒸餾水于錐形瓶中,用石灰乳調(diào)pH至7.5,在溫度37℃、超聲時(shí)間10min、冷卻后離心,合并2次上清液,將沉淀加40mL蒸餾水于錐形瓶中,用石灰乳調(diào)pH至8.5,在溫度37℃、超聲提取10min、冷卻后離心5min,合并3次上清液,將上清液在45℃,0.08Mpa減壓濃縮,將濃縮液移至50mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度,測(cè)定提取液黃酮含量。

1.2.1.4 水提提取 水提提取國(guó)槐葉黃酮參照文獻(xiàn)[17]。稱取2g國(guó)槐葉粉末,按料液比1∶40加入蒸餾水,用1mol/L HCl調(diào)pH至4,沸水浴提取30min,冷卻后離心,上清液在45℃,0.08Mpa減壓濃縮后置于50mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度,測(cè)定提取液黃酮含量。

1.2.1.5 超聲波輔助雙水相堿性體系提取 稱取2g國(guó)槐葉粉末,按料液比1∶40加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%硫酸銨組成的雙水相體系,用1mol/L NaOH調(diào)pH至8,在溫度41℃、超聲提取21min、冷卻后轉(zhuǎn)入分液漏斗中分相,將上相在45℃,0.08Mpa減壓濃縮后置于50mL容量瓶中[14],用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至刻度,測(cè)定提取液黃酮含量。

1.2.2 國(guó)槐葉黃酮含量測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[18],準(zhǔn)確稱取蘆丁0.02g于100mL燒杯中,加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇超聲溶解,溶解后,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至刻度。準(zhǔn)確吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中,加體積質(zhì)量5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,混勻,靜置6min。加入體積質(zhì)量10%硝酸鋁溶液0.30mL,混勻,靜置6min,加體積質(zhì)量4%氫氧化鈉溶液4mL,用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容至刻度,搖勻,靜置15min。以不加蘆丁為空白對(duì)照。在510nm下測(cè)定吸光值。以蘆丁含量(mg)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取0.5mL黃酮提取物于10mL容量瓶中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定樣品的吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮含量。

式中:C為提取物中黃酮含量(mg),V為總樣品體積(mL),W為樣品重量(g),v為測(cè)定的樣品體積(mL),N為稀釋倍數(shù)。

1.3抗氧化活性測(cè)定

1.3.1 不同方法黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用 參照文獻(xiàn)[19-20]稍作修改,在試管中分別加入2mL不同提取方法提取的不同質(zhì)量濃度的國(guó)槐葉黃酮提取物,加入2.00mL0.15mmol/LDPPH乙醇溶液,搖勻,放置30min,以2.00mL無(wú)水乙醇代替樣品和2.00mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇混合后作為參比,測(cè)定517nm波長(zhǎng)處的吸光度(Ai)?？瞻讓?duì)照組以2.00mL無(wú)水乙醇代替樣品,測(cè)定517nm波長(zhǎng)處的吸光度(A0),DPPH自由基清除率按以下公式計(jì)算。

式中:A0-不加黃酮的吸光值,Ai-樣品的吸光值。

1.3.2 不同方法黃酮提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用 參照文獻(xiàn)[14]稍作修改,在試管中分別加入用不同提取方法提取的不同質(zhì)量濃度的國(guó)槐葉黃酮提取物0.2mL,然后加入1.2mL的ABTS,再用體積分?jǐn)?shù) 70%的乙醇補(bǔ)充至4mL,混合,靜置6min,在745nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度Ai；以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇代替樣液作為空白對(duì)照在745nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度A0,ABTS自由基清除率按以下公式計(jì)算。

式中:A0-不加黃酮的吸光值,Ai-樣品的吸光值。

1.3.3 不同方法黃酮提取物對(duì)鐵離子的螯合能力 鐵離子的螯合能力參見(jiàn)文獻(xiàn)[21],在試管中分別加入1.0mL不同質(zhì)量濃度的國(guó)槐葉黃酮提取物與2.5mL甲醇,加入0.1mL2mmoL/LFeCl2混合,再加入0.2mL5mmol/LFerrozine試劑,充分混勻。室溫條件下反應(yīng)20min后,在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(Ai)；同時(shí)用乙醇代替提取物測(cè)對(duì)照A0。每個(gè)樣品重復(fù)3次,按下式計(jì)算鐵離子螯合率。

式中:A0-不加黃酮的吸光值,Ai-樣品的吸光值。

1.3.4 不同方法黃酮提取物的銅離子還原力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[21-22],還原力以吸光度的大小來(lái)表示,吸光度越大還原力越強(qiáng)。

1.3.5 不同方法黃酮提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性的測(cè)定 硫氰酸銨比色法[23],對(duì)亞油酸過(guò)氧化的抑制率按下式計(jì)算。

式中:A0-不加黃酮的吸光值,Ai-樣品的吸光值。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖,多重比較采用DPS12.5軟件進(jìn)行分析。以上測(cè)定均重復(fù)三次,圖中數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1不同提取方法提取國(guó)槐葉黃酮的比較

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得直線回歸方程:Y=0.7350x-0.0159；R2=0.9932,依據(jù)回歸方程計(jì)算不同提取方法提取物中黃酮含量結(jié)果見(jiàn)圖1,從圖1可以看出,幾種提取物中均含有黃酮類化合物,其中,回流提取物中黃酮含量最高,其次為超聲波輔助雙水相和超聲波輔助雙水相堿性提取物,水提提取最低,多重比較顯示,回流提取與超聲波輔助雙水相提取以及超聲波輔助雙水相與超聲波輔助雙水相堿性提取黃酮含量差異不顯著(p>0.05),而與半仿生,水提提取之間黃酮含量差異顯著(p<0.05),以上結(jié)果表明,國(guó)槐葉黃酮易溶于乙醇,醇提有利于黃酮的溶出。

圖1 提取方法對(duì)國(guó)槐葉黃酮的影響Fig.1 Effect of extraction methods on flavonoids content from Sophora japonica leaves

2.2抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 國(guó)槐葉不同方法黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用 國(guó)槐葉5種方法提取物對(duì)DPPH自由基的清除效果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出,當(dāng)對(duì)DPPH自由基的清除率為50%時(shí),超聲波輔助雙水相提取、回流提取、半仿生提取、水提提取、超聲波輔助雙水相堿性提取的所需國(guó)槐葉黃酮分別為64.92、88.00、80.00、68.00和74.00μg/mL,超聲波輔助雙水相提取的國(guó)槐葉黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力最佳,李彩霞等[14]對(duì)超聲波輔助雙水相提取的國(guó)槐葉黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力進(jìn)行了研究,提取液未減壓濃縮直接測(cè)定DPPH自由基清除能力,而本實(shí)驗(yàn)提取液提取后經(jīng)45℃減壓濃縮,置于室溫避光條件下保存,在濃縮和存貯過(guò)程中有部分黃酮類物質(zhì)可能被氧化,因此測(cè)定的IC50高于文獻(xiàn)所報(bào)道的值。后續(xù)對(duì)其影響穩(wěn)定性的因素需要進(jìn)一步研究。

圖2 對(duì)DPPH自由的清除作用Fig.2 Scavenging effect of flavonoids on DPPH radical

2.2.2 國(guó)槐葉不同方法黃酮提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用 從圖3可知,超聲波輔助雙水相提取、回流提取、半仿生提取、水提提取、超聲波輔助雙水相堿性提取的提取物中黃酮質(zhì)量濃度為34μg/mL時(shí),對(duì)ABTS自由基清除率分別為57.01%、21.67%、18.00%、39.70%、72.50%,該數(shù)據(jù)表明,超聲波輔助雙水相堿性和超聲波輔助雙水相提取的國(guó)槐葉黃酮提取物對(duì)ABTS自由基清除能力最好。

圖3 對(duì)ABTS自由的清除作用Fig.3 Scavenging effect of flavonoids on ABTS radical

2.2.3 國(guó)槐葉不同方法黃酮提取物對(duì)鐵離子的螯合能力 抗氧化活性的一個(gè)重要機(jī)制是螯合某些金屬離子,而后者可以催化氫過(guò)氧化物的降解以及Fenton類反應(yīng),從而抑制了氧化作用,因此,亞鐵離子螯合能力的測(cè)定在天然產(chǎn)物抗氧化活性評(píng)價(jià)中具有非常重要的意義[24]。

國(guó)槐葉不同提取方法黃酮提取物對(duì)亞鐵離子螯合能力結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出,超聲波輔助雙水相提取、回流提取、半仿生提取、水提提取、超聲波輔助雙水相堿性提取的提取物中黃酮質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí),對(duì)亞鐵離子的螯合力分別為59.62%、35.82%、33.33%、53.32%、83.45%,其變化趨勢(shì)與對(duì)ABTS自由的變化趨勢(shì)一致,即超聲波輔助雙水相堿性提取的國(guó)槐葉黃酮提取物對(duì)鐵離子螯合能力最佳,其次為超聲波輔助雙水相提取。

圖4 鐵離子的螯合能力測(cè)定Fig.4 Determination of iron ion chelating ability

2.2.4 國(guó)槐葉不同方法黃酮提取物對(duì)銅離子的還原力 還原能力是衡量抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo),也是抗氧化機(jī)理之一?？寡趸瘎┩ㄟ^(guò)自身的抗氧化作用給出電子而清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng),因此可以通過(guò)檢測(cè)提取物還原力的大小來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的大小[25]。

從圖5可以看出,當(dāng)還原能力為50%時(shí)(還原能力實(shí)驗(yàn)中450nm處OD值為0.5 時(shí)樣品的濃度)5種提取物中黃酮的質(zhì)量濃度為超聲波輔助雙水相(105.61μg/mL)、回流(112.18μg/mL)、半仿生(128.30μg/mL)、水提(106.50μg/mL)、超聲波輔助雙水相(堿)126.00μg/mL,對(duì)銅離子還原力的順序?yàn)槌暡ㄝo助雙水相>水提>回流>超聲波輔助雙水相(堿)>半仿生。

圖5 銅離子還原力的測(cè)定Fig.5 The determination of copper ion reducing power

2.2.5 國(guó)槐葉不同方法黃酮提取物對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性的影響 亞油酸體系是評(píng)價(jià)食品中抗氧化劑作用最常見(jiàn)的檢測(cè)體系。含有不飽和脂肪酸的油脂,在各種條件的催化下,脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化物將Fe2+氧化成Fe3+,Fe3+與硫氰酸反應(yīng),生成的硫氰酸鐵在510nm處有強(qiáng)吸收[26],如果在反應(yīng)體系中添加抗氧化劑,就會(huì)抑制亞油酸的氧化,吸光值越小,說(shuō)明抗氧化能力越強(qiáng)。國(guó)槐葉不同提取方法黃酮提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可以看出,在提取物黃酮質(zhì)量濃度為0.8mg/L時(shí),對(duì)亞油酸的抑制能力的強(qiáng)弱為回流(80.53%)>超聲波輔助雙水相(堿 61.44%)>半仿生(42.42%)>超聲波輔助雙水相(39.16%)>水提(35.12%),說(shuō)明回流提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力較強(qiáng)。

圖6 黃酮提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性Fig.6 Inhibitory activity of FTAP on linoleic acid peroxidation

3 結(jié)論與討論

黃酮是一類復(fù)雜的化合物,不同極性的提取劑、不同的提取方法對(duì)特定結(jié)構(gòu)的組分溶出有一定選擇性[27],對(duì)不同的方法提取的黃酮的功能進(jìn)行分析,有助于進(jìn)一步探討黃酮各種活性的構(gòu)效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,回流提取物中黃酮含量較高,其次為超聲波輔助雙水相和超聲波輔助雙水相堿性體系,水提提取最低。半仿生和水提提取,其溶劑為蒸餾水,提取效率相對(duì)前三種方法較低,說(shuō)明國(guó)槐葉黃酮易溶于有機(jī)溶劑中。5種提取物對(duì)幾種自由基均具有抗氧化活性,對(duì)自由基的清除效果顯示出醇提取物的抗氧化活性優(yōu)于水提取物。

5種提取方法所得國(guó)槐黃酮含量不同,回流提取黃酮含量最高,但從抗氧化活性角度分析,雙水相提取活性更高,其原因是雙水相提取時(shí)間短,溫度低活性成分保持較好。因此,中草藥提取方式的取舍并不能以簡(jiǎn)單的提取率為依據(jù),應(yīng)該跟蹤檢查其組分和活性,以探究各組成成分與抗氧化活性的關(guān)系。國(guó)槐作為重要的藥用植物,目前,對(duì)于槐米和槐角研究較多,但是國(guó)槐葉資源豐富,活性成分較多[28],為充分利用該資源,探索活性成分提取技術(shù),結(jié)果顯示超聲波輔助雙水相技術(shù)提取物中顯示出更好的抗氧化性；活性成分易溶于乙醇中,乙醇毒性低,相比較水提取雜質(zhì)少,后續(xù)處理省時(shí),該研究為國(guó)槐葉活性成分的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the extraction method and antioxidant activity of flavonoids fromSophorajaponicaL.

LIXiao-yong1,HUOXi-dong1,YANGZi-yong1,ZHANGYong1,2,LICai-xia1,2,*

(1.College of Agriculture and Biotechnology,Hexi University,Zhangye 734000,China;2. Key laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Universities,Hexi University,Zhangye 734000,China)

The study aimed to explore the flavonoids contents and antioxidant activity of diffrerent extracts fromSophorajaponicaL by ultrsonoc-assisted aqueous two-phase extraction(UATPE),reflux extraction(RE),Semi-bionic extraction(SBE),water extraction(WE),Ultrasonic assisted aqueous two-phase(alkaline UATPEA),respectively. The results indicated that the content of flavonoids extracted by RE was the highest,which showed a significant difference(p<0.05)compared with other methods except for UATPE(p>0.05). The antioxidant results showed that flavonoids extracts by the five different methods obtaining had strong antioxidant activity.The scavenging ability of DPPH free radical and reduction of copper ions of flavonoids extracted by UATPE was the strongest. In addition,ABTS radical scavenging effect and iron ion chelating power of UATPEA flavonoids extractes were the best than that of other methods. Moreover,the extracts obtained by different methods inhibition linoleic acid was RE>UATPE>SBE>UATPEA>WE. The results indicated that the flavonoids inSophorajaponicaL are soluble in organic solvent. The extracts obtained by UATPE has better antioxidant activity.

SophorajaponicaL. leave;flavonoids;extraction methods;antioxidant activity

2013-12-12 *通訊聯(lián)系人

李小勇(1991-)，男，本科，研究方向:天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用。

國(guó)家中醫(yī)藥管理局2012年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng) (201207002)。

TS201.2

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001